ऑक्यूलर माइक्रोवैस्कुलर एंजियोजेनेसिस का एक पूर्व वीवो कोरॉइड स्प्राउटिंग परख
Summary
यह प्रोटोकॉल कोरॉयड अंकुरण परख प्रस्तुत करता है, जो माइक्रोवैस्कुलर प्रसार का एक पूर्व वीवो मॉडल है। इस परख का उपयोग कोरोइडल माइक्रो जहाजों के प्रसार में शामिल रास्तों का आकलन करने और जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस ऊतक का उपयोग करके दवा उपचार का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
पैथोलॉजिकल कोरॉयड एंजियोजेनेसिस, उम्र से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन की एक प्रमुख विशेषता, दृष्टि हानि और अंधापन की ओर जाता है। एंडोथेलियल सेल (ईसी) प्रसार परिध मानव रेटिना माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचआरएमईसी) या अलग प्राथमिक रेटिना ईसी का उपयोग रेटिना एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए विट्रो मॉडल में व्यापक रूप से किया जाता है। हालांकि, शुद्ध मुरीन रेटिना एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और रेटिना एसी में कोरॉयड एंडोथेलियल कोशिकाओं और विभिन्न सेल/सेल इंटरैक्शन की तुलना में अलग-अलग प्रसार प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं। कोरोइडल माइक्रोवैस्कुलर प्रसार के मॉडल के रूप में एक अत्यधिक प्रजनन योग्य पूर्व वीवो कोरो कोरॉइडल अंकुरण परख विकसित की गई थी। इस मॉडल में कोरॉइड वैक्यूलेचर (ईसी, मैक्रोफेज, पेरिसाइट्स) और रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) के बीच बातचीत शामिल है। माउस आरपीई/कोरॉयड/स्क्लेरल एक्सप्लांट्स को विकास-कारक-कम बेसल झिल्ली निकालने (बीएमई) (दिन 0) में अलग-थलग और इनक्यूबेटेड किया जाता है । मध्यम हर दूसरे दिन बदल जाता है और 6 दिन में कोरॉइड अंकुरण की मात्रा निर्धारित की जाती है। व्यक्तिगत कोरॉइड एक्सप्लांट की छवियों को एक उल्टे चरण माइक्रोस्कोप के साथ लिया जाता है और अंकुरण क्षेत्र को इस प्रयोगशाला में विकसित इमेजजे सॉफ्टवेयर में अर्ध-स्वचालित मैक्रो प्लग-इन का उपयोग करके मात्रा निर्धारित किया जाता है। इस प्रजनन पूर्व वीवो कोरोइडल अंकुरण परख का उपयोग संभावित उपचार के लिए यौगिकों का आकलन करने और सूक्ष्मवहन रोग अनुसंधान के लिए जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस ऊतक का उपयोग करके कोरॉयडल माइक्रो पोत प्रसार में शामिल रास्तों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
कोरॉइडल एंजियोजेनेसिस डिस्रेगुलेशन नियोवैस्कुलर उम्र से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन (एएमडी)1से जुड़ा हुआ है। कोरॉयड रेटिना वर्णक एपिथेलियम (आरपीई) के नीचे मौजूद एक माइक्रोवैस्कुलर बिस्तर है। यह दर्शाया गया है कि कोरॉइड में रक्त प्रवाह में कमी एएमडी2की प्रगति से जुड़ी हुई है . संवहनी एंडोथेलियम, आरपीई, मैक्रोफेज, पेरिसाइट्स और अन्य कोशिकाओं के बीच जटिल संबंधऊतक3,4,5के होमोसेस्टेसिस के लिए जिम्मेदार है। इसलिए, नेओवैस्कुलर एएमडी के अध्ययन के लिए एक प्रजनन योग्य परख मॉडलिंग कोरोइडल माइक्रोएनवायरमेंट महत्वपूर्ण है।
पूर्व वीवो एंजियोजेनेसिस परख और इन विट्रो एंडोथेलियल सेल संस्कृतियां वीवो में माइक्रोवैस्कुलर व्यवहार के अध्ययनों को पूरक कर सकती हैं, नई दवाओं के परीक्षण के लिए और रोगजनन के अध्ययन के लिए। एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसे मानव रेटिना माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं (एचआरएमईसी), मानव नाभि नस एंडोथेलियल कोशिकाएं (एचयूवीईसी), अलग प्राथमिक पशु मस्तिष्क या रेटिना एसी का उपयोग अक्सर नेत्र एंजियोजेनेसिसअनुसंधान6, 7,8 के लिए विट्रो अध्ययन में कियाजाताहै। विशेष रूप से एचआरएमईसी को एंडोथेलियल प्रसार, माइग्रेशन, ट्यूबलरगठन और संवहनी रिसाव का आकलन करके इन विट्रो कोरॉइडल नियोवैस्कुलराइजेशन (सीएनवी) 9 के मॉडल के रूप में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है ताकि हस्तक्षेप6,10का मूल्यांकन किया जा सके। हालांकि, संस्कृति में ईसी सीएनवी के मॉडल के रूप में सीमित हैं क्योंकि कोरॉइड में पाए जाने वाले अन्य सेल प्रकारों के साथ बातचीत की कमी है और क्योंकि इन परखों में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश ईसी कोरॉइड से उत्पन्न नहीं होते हैं। माउस कोरॉयड ईसीएस को संस्कृति में अलग करना और बनाए रखना मुश्किल है।
महाधमनी अंगूठी परख व्यापक रूप से मैक्रो संवहनी प्रसार के एक मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है। महाधमनी एक्सप्लांट से संवहनी अंकुरित में ईसीएस, पेरिसाइट्स और मैक्रोफेज11शामिल हैं। महाधमनी अंगूठी परख बड़े पोत एंजियोजेनेसिस को 12 ,13,14में मॉडल बनाती है । हालांकि, इसकी सीमाएं कोरोइडल नियोवैस्कुलराइजेशन के मॉडल के रूप में हैं क्योंकि महाधमनी छल्ले एक मैक्रोवैस्कुलर ऊतक हैं जिसमें विशेषता कोरॉइडल माइक्रोवैस्कुलर वातावरण की कमी होती है, और बड़े जहाजों से अंकुरित स्प्राउट्स माइक्रोवैस्कुलर पैथोलॉजी में शामिल केशिका नेटवर्क से अंकुरित से भिन्न हो सकते हैं। हाल ही में एक समूह ने एक पूर्व वीवो रेटिना परख15,16प्रकाशित की । हालांकि, यह रेटिना नियोवैस्कुलर रोग के लिए उपयुक्त है, यह एएमडी में देखे गए कोरॉयड नियोवैस्कुलराइजेशन के लिए उतना उपयुक्त नहीं है।
माउस आरपीई, कोरॉयड, और स्क्लेरल एक्सपेल्ड ऊतक का उपयोग करके कोरॉइड स्प्राउटिंग परख को बेहतर मॉडल सीएनवी के लिए विकसित किया गया था। ऊतक आसानी से माउस (या अन्य प्रजातियों) आंखों से अलग किया जा सकता है17। यह परख फार्माकोलॉजिक यौगिकों की प्रो-और एंटी-एंजियोजेनिक क्षमता के प्रजनन योग्य मूल्यांकन और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से ऊतक का उपयोग करके कोरॉइडल नियोवैस्कुलराइजेशन में विशिष्ट रास्तों की भूमिका का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है और18को नियंत्रित करता है। इस कोरॉयड अंकुरण की परख का उल्लेख बाद के कई प्रकाशनों 9 ,10,18,19,20में किया गया है . यहां इस परख के इस्तेमाल में शामिल विधि का प्रदर्शन किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कोरोइडल अंकुरित परख से नियोवैस्कुलर एएमडी 9 ,10,18,19,20में शोध होता है . कोरॉयड एक्सप्लांट को चूहों के साथ – साथ चूहों और मनुष्यों से अलग किया जा स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को मैनपेई सुजुकी डायबिटिक फाउंडेशन (वाईटी), बोस्टन चिल्ड्रन हॉस्पिटल ओएफडी/बीआरईआरसी/सीटीआरईसी फैकल्टी करियर डेवलपमेंट ग्रांट, बोस्टन चिल्ड्रन हॉस्पिटल ऑप्थेलमोलॉजी फाउंडेशन, बीसीएच पायलट अवार्ड, बीसीएच मैन्टन सेंटर फेलोशिप और लिटिल जिराफ फाउंडेशन (जेडएफ), जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । बीसी के लिए [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, बीसीएच IDDRC (1U54HD090255), मैसाचुसेट्स लायंस आई फाउंडेशन (LEHS) ।
Materials
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
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