Ein Ex Vivo Choroid Sprouting Assay der ocular Microvascular Angiogenese
Summary
Dieses Protokoll stellt einen Aderhautkeim-Assay dar, ein Ex-vivo-Modell der mikrovaskulären Proliferation. Dieser Test kann verwendet werden, um Wege zu bewerten, die an sich vermehrenden aderatorischen Mikrogefäßen beteiligt sind, und medikamentöse Behandlungen mit Wildtyp und genetisch verändertem Mausgewebe zu bewerten.
Abstract
Die pathologische Aderhautangiogenese, ein markantes Merkmal der altersbedingten Makuladegeneration, führt zu Sehstörungen und Erblindung. Endotheliale Zell(E-Zell-Assays mit humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HRMECs) oder isolierten primären retinalen ECs sind weit verbreitet in vitro-Modelle zur Untersuchung der retinalen Angiogenese. Die Isolierung reiner muriner retinaler Endothelzellen ist jedoch technisch anspruchsvoll und netzhautförmige ECs können andere Proliferationsreaktionen haben als aderhautförmige Endothelzellen und verschiedene Zell-/Zell-Wechselwirkungen. Es wurde ein hochreproduzierbarer ex vivo aderhautspessender Assay als Modell der choroidalen mikrovaskulären Proliferation entwickelt. Dieses Modell umfasst die Wechselwirkung zwischen Derhautvaskulatur (EC, Makrophagen, Pericyten) und retinalem Pigmentepithel (RPE). Maus-RPE/Choroid/Skleralexplanten werden isoliert und in wachstumsfaktorreduziertem Basalmembranextrakt (BME) (Tag 0) inkubiert. Medium wird jeden zweiten Tag verändert und Die Aderhautsprossen wird an Tag 6 quantifiziert. Die Bilder einzelner Aderhautexplantationen werden mit einem invertierten Phasenmikroskop aufgenommen und der Keimbereich wird mit einem halbautomatischen Makro-Plug-in zur in diesem Labor entwickelten ImageJ-Software quantifiziert. Dieser reproduzierbare Ex-vivo-Chorsponnen-Sprossen-Assay kann verwendet werden, um Verbindungen für eine mögliche Behandlung und für die Forschung an mikrovaskulären Erkrankungen zu bewerten, um Wege zu bewerten, die an der Verbreitung von Aderhautmikrogefäßen mit Wildtyp und genetisch verändertem Mausgewebe beteiligt sind.
Introduction
Die Dysregulation der Choroidalangiogenese ist mit der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration (AMD)1verbunden. Die Aderhaut ist ein mikrovaskuläres Bett unter dem retinalen Pigmentepithel (RPE). Es hat sich gezeigt, dass ein reduzierter Blutfluss in der Aderhaut mit der Progression von AMD2verbunden ist. Die komplizierte Beziehung zwischen vaskulärem Endothel, RPE, Makrophagen, Pericyten und anderen Zellen ist verantwortlich für die Homöostase des Gewebes3,4,5. Daher ist eine reproduzierbare Assaymodellierung der aderatorischen Mikroumgebung für die Untersuchung der neovaskulären AMD von entscheidender Bedeutung.
Ex-vivo-Angiogenese-Assays und in vitro endotheliale Zellkulturen können Studien über mikrovaskuläres Verhalten in vivo, zur Erprobung neuer Medikamente und für Studien zur Pathogenese ergänzen. Endothelzellen wie menschliche mikrovaskuläre Endothelzellen (HRMECs), Human Umbilical Venin Endothelial Cells (HUVEC), isolierte primäre tierische Gehirne oder netzretinale ECs werden häufig in In-vitro-Studien zur okulären Angiogeneseforschung6,7,8verwendet. Insbesondere HRMECs wurden weithin als Modell der in vitro choroidalen Neovaskularisation (CNV)9 verwendet, indem die endotheliale Proliferation, Migration, tubuläre Bildung und vaskuläre Leckage bewertet wurden, um die Interventionen6,10zu bewerten. Jedoch, ECs in der Kultur sind als Modell der CNV begrenzt, weil es an Wechselwirkungen mit anderen Zelltypen in der Aderhaut gefunden und weil die meisten EC in diesen Assays verwendet stammen nicht von Derader. Maus-Aderhaut-ECs sind in der Kultur schwer zu isolieren und zu pflegen.
Der Aortenring-Assay wird weithin als Modell der makrovaskulären Proliferation verwendet. Zu den Gefäßsprossen von Aortenexpflanzen gehören ECs, Pericyte und Makrophagen11. Der Aortenring-Assay modelliert große Gefäßangiogenese gut12,13,14. Es hat jedoch Einschränkungen als Modell der choroidalen Neovaskularisation, da Aortenringe ein makrovaskuläres Gewebe sind, das nicht die charakteristische choroidale mikrovaskuläre Umgebung aufweist, und Sprossen aus großen Gefäßen können sich von Sprossen aus Kapillarnetzwerken unterscheiden, die an mikrovaskulärer Pathologie beteiligt sind. Kürzlich veröffentlichte eine Gruppe einen Ex-vivo-Retina-Assay15,16. Obwohl, Es ist geeignet für retinale neovaskuläre Erkrankungen, Es ist nicht so geeignet für choroidale Neovaskularisation wie bei AMD gesehen.
Der aderodiensprosende Assay mit Maus-RPE, Aderhaut und skleral explantiertem Gewebe wurde entwickelt, um CNV besser zu modellieren. Das Gewebe kann leicht von Maus (oder anderen Arten) Augen isoliert werden17. Dieser Test ermöglicht eine reproduzierbare Bewertung des pro- und antiangiogenetischen Potenzials von pharmakologischen Verbindungen und die Bewertung der Rolle spezifischer Wege bei der choroidalen Neovaskularisation mit Gewebe von genetisch veränderten Mäusen und Kontrollen18. Dieser aderhautspaltnde Assay wurde in vielen nachfolgenden Publikationen9,10,18,19,20erwähnt. Hier wird die Methode demonstriert, die bei der Verwendung dieses Assays zum Einsatz kommt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der choroidal sprossende Assay unterstützt die Forschung in neovaskulären AMD9,10,18,19,20. Aderhautexplantationen können sowohl von Mäusen als auch von Ratten und Menschen isoliert werden17,21. Die Aderhautexplantation umfasst ECs, Makrophagen und Pericyten17. In diesem Tes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien der Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children es Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children es Hospital Ophthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship, und Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; to BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).
Materials
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
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