이 프로토콜은 마이크로 혈관 증식의 전 생체 모델인 초로이드 발아 분석체를 제시합니다. 이 분석체는 코로이드 마이크로 혈관의 증식에 관여하는 경로를 평가하고 야생 유형 및 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 약물 치료를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
노화와 관련된 황반 변성의 현저한 특징인 병리학적인 천동 혈관신생은 시력 장애와 실명으로 이어집니다. 인체망막 내피 세포(EC) 증식 분석(HRMEC) 또는 분리된 1차 망막 IC를 이용한 증식 분석은 생체외 모델에서 망막 혈관신생을 연구하는 데 널리 사용된다. 그러나, 순수한 뮤린망 내피 세포를 격리하는 것은 기술적으로 도전적이고 망막 EC는 choroidal 내피 세포 및 다른 세포/세포 상호 작용과 다른 증식 반응을 가질 수 있다. 초로이드 미생물 증식의 모델로서 매우 재현 가능한 전 생체 균 발아 분석이 개발되었다. 이 모형은 choroid 혈관분기 (EC, 대식세포, pericytes) 및 망막 안료 상피 (RPE)사이 상호 작용을 포함합니다. 마우스 RPE/choroid/scleral 이병은 성장 인자 감소 기막 추출물(BME)(일 0)에서 분리되고 배양됩니다. 배지는 격일로 변경되고 코로이드 발아는 6일째에 정량화된다. 개별 choroid explant의 이미지는 반전된 상 현미경으로 촬영되고 발아 영역은 이 실험실에서 개발된 ImageJ 소프트웨어에 반자동 매크로 플러그인을 사용하여 정량화됩니다. 이 재현 가능한 ex vivo choroidal 발아 분석은 야생 유형 및 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 choroidal 마이크로 혈관 증식에 관여하는 경로를 평가하기 위해 잠재적 인 치료 및 마이크로 혈관 질환 연구에 대한 화합물을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
Choroidal 혈관 신생 이소화 조절은 신생 혈관 노화 관련 황반 변성 (AMD)1과관련이 있습니다. choroid는 망막 색소 상피 (RPE) 아래에 존재하는 미세 혈관 침대입니다. 코로이드의 혈류감소는 AMD2의진행과 관련이 있는 것으로 나타났다. 혈관 내피, RPE, 대식세포, 회낭체 및 기타 세포 사이의 복잡한 관계는 조직3,4,5의항상성에 대한 책임이 있다. 따라서, 재현 가능한 분석 모델링 choroidal 마이크로 환경은 neovascular AMD의 연구에 대 한 중요 한.
전 생체 혈관 신생 분석 및 체외 내피 세포 배양은 생체 내 미생물 의 행동, 신약 테스트 및 병인의 연구를 보완 할 수 있습니다. 인간 망막 미생물 내피 세포(HRMEC), 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC), 격리된 원발성 동물 뇌 또는 망막 IC와 같은 내피 세포는 종종 안구 혈관 신생 연구6,7,
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프로토콜
설명된 모든 동물 실험은 보스턴 아동 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다 (ARCH 프로토콜 번호 19-04-3913R).
1. 준비
- 페니실린/스트렙토마이신(10000 U/mL)과 5mL 및 10mL의 상용 보충제를 500mL의 완전한 클래식 매체에 추가합니다. Aliquot 50 mL 의 배지 는 처음에.
참고: 오염을 방지하기 위해 배지를 재고로 되돌리지 마십시오. - 얼음에 완전한 클래식 매체의 알리쿼트를 넣습니다.
- 70%의 에탄올을 사용하여 해부하는 현미경, 집게 및 가위를 청소하십시오.
- 2개의 세포 배양 접시 (10cm), 해부 현미경에 하나, 얼음에 하나 준비; 각 접시에 완전한 클래식 매체 10 mL을 넣습니다.
2. 실험 단계(그림 1)
- 산후 (P) 주위에 C57BL/6J 마우스를 희생 (P) 20 75-100 mg/kg 케타민과 7.5-10 mg/kg 자일라진 주입을 사용 하 여. 해부 전에 얼음에 완전한 고전적인 매체에 눈을 유지합니다.
- 눈에 결합 조직 (근육과 지방 조직) 및 시....
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결과
하루에 빛나는 choroid 의 성장의 비교
우리는 BME에 내장 된 sclera로 choroid를 해부하고 6 일 동안 배양(그림 1). 3일부터 6일까지 C57BL/6J 마우스에서 의초로이드 발아는 현미경으로 검사되었고 IMAGEJ에서 반자동 정량화 방법인 SWIFT-Choroid로 정량화되었다. 대표적인 경우, 축출면적(축출자체를 제외한 각성으로부터 연장된 혈관)은 3일째 0.38mm2(그림 3A),4일째 1.47mm2(그림 3B),5.62mm2(그림 3C),6일째 10.09mm2일(그림 3D)이었다.<.......
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토론
천로이드 발아 분석체는 NEovascular AMD9,10,18,19,20에서연구를 돕습니다. 초로이드 이질은 쥐뿐만 아니라 쥐와인간(17,21)으로부터분리될 수 있다. choroid 축출에는 EC, 대식세포 및 pericytes17이포함됩니다. 이 분석에서 choroidal IC와 RPE 세포와 같은 인접 한 세포 간의 상호 작용, choroidal 혈관 성장에 관련 된 메커니즘을 해명 하는 데 도움이(17). 또한, 이러한 재현 가능한 반자동 평가 .......
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공개 사항
저자는 재정 적 공개가 없습니다. 전산화 된 방법은 저자를 통해 교육 기관에 무료로 사용할 수 있습니다.
감사의 글
이 작품은 만페이 스즈키 당뇨병 재단 (YT), 보스턴 아동 병원 OFD / BTREC / CTREC 교수 진로 개발 보조금, 보스턴 아동 병원 안과 재단, BCH 파일럿 상, BCH 맨튼 센터 펠로우십의 보조금에 의해 지원되었다, 리틀 기린 재단 (ZF), 독일 연구 재단 (DFG; BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD)
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| 기저 막 추출물 (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| 세포 배양 접시 | NEST | 704001 | 10cm |
| 혈청 및 CultureBoost 세포 시스템이 포함 된 완전한 클래식 배지 | 4Z0-500 | ||
| 에틸 알코올 200 Proof | Pharmco | 111000200 | 70 % 사용 |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| 현미경 | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| 조직 배양 플레이트(24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII(케타민) | AKORN | 59399-114-10 |
참고문헌
- Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
- Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Oph....
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재인쇄 및 허가
