Dette manuskript beskriver en protokol for neutronradiografi og computertomografi af biologiske prøver ved hjælp af en CG-1D-strålelinje med høj fluxisotopreaktor (HFIR) til måling af et metalimplantat i et rottelårben, en muselunge og et urteagtigt planterod/jordsystem.
Neutroner er historisk blevet brugt til en bred vifte af biologiske anvendelser, der anvender teknikker såsom småvinkel neutronspredning, neutronspinekko, diffraktion og uelastisk spredning. I modsætning til neutronspredningsteknikker, der opnår information i det gensidige rum, måler dæmpningsbaseret neutronbilleddannelse et signal i det virkelige rum, der løses i størrelsesordenen titusinder af mikrometer. Princippet om neutronbilleddannelse følger Beer-Lambert-loven og er baseret på måling af bulkneutrondæmpningen gennem en prøve. Større dæmpning udvises af nogle lette elementer (især hydrogen), som er hovedkomponenter i biologiske prøver. Kontrastmidler såsom deuterium, gadolinium eller lithiumforbindelser kan bruges til at forbedre kontrasten på samme måde som det gøres i medicinsk billeddannelse, herunder teknikker som optisk billeddannelse, magnetisk resonansbilleddannelse, røntgen og positronemissionstomografi. For biologiske systemer er neutronradiografi og computertomografi i stigende grad blevet brugt til at undersøge kompleksiteten af det underjordiske planterodnetværk, dets interaktion med jord og dynamikken i vandflux in situ. Desuden er bestræbelser på at forstå kontrastdetaljer i dyreprøver, såsom blødt væv og knogler, blevet undersøgt. Dette manuskript fokuserer på fremskridtene inden for neutronbioimaging såsom prøveforberedelse, instrumentering, dataindsamlingsstrategi og dataanalyse ved hjælp af High Flux Isotope Reactor CG-1D neutronbilleddannelsesstrålelinjen. De førnævnte evner vil blive illustreret ved hjælp af et udvalg af eksempler inden for plantefysiologi (urteagtig plante / rod / jordsystem) og biomedicinske anvendelser (rottelårben og muselunge).
Princippet om neutronradiografi (nR) er baseret på dæmpning af neutroner gennem det stof, de krydser. I modsætning til røntgenstråler, der spredes af et atoms elektronsky, kan neutroner absorberes eller spredes af kernen. Neutroner er følsomme over for lette grundstoffer, såsom hydrogen (H), og kan derfor anvendes til røntgenfotografering af biologiske anvendelser såsom dyr 1,2,3,4,5,6,7 eller humant væv 8,9 og jord-/rodsystemer under jorden 10,11,12,13,14 ,15. Neutronbilleddannelse er en komplementær teknik til røntgenbilleddannelse, som er i stand til at detektere tunge grundstoffer16,17,18. Dæmpningsbaseret nR styres af de lineære dæmpningskoefficienter for materialerne i prøven og af prøvens tykkelse, som beskrevet i Beer-Lambert-loven, der siger, at den transmitterede stråle er direkte proportional med mængden af materiale og banelængden gennem materialet. Således kan transmittansen, T, beregnes som:
(1)
hvor I 0 og I er henholdsvis indfaldende og transmitterede stråleintensiteter; μ og x er henholdsvis den lineære dæmpningskoefficient og tykkelsen af en homogen prøve. Dæmpningskoefficienten μ er givet ved:
(2)
hvor σ er prøvens neutrondæmpningstværsnit (både spredning og absorption), ρ er dens densitet, NA er Avogadros tal, og M er dens molære masse.
Kontrast i radiografi af biologiske prøver ved hjælp af lavenergineutroner (dvs. energier under 0,5 eV) skyldes hovedsagelig en ændring i densiteten af H (for en fast prøvetykkelse). Dette skyldes sandsynligheden for interaktion mellem en neutron og H-kernen, som er større end med andre kerner, der er til stede i biologiske prøver, og det faktum, at H-atomets tæthed er afgørende, da det er det mest rigelige atom i biologiske prøver.
Siden sine tidlige stadier er nR og neutroncomputertomografi (nCT) blevet brugt i vid udstrækning til materialer og tekniske applikationer 19,20,21,22,23. De første demonstrationsforsøg med neutronfølsomhed over for H i biologiske prøver begyndte i midten af 1950’erne24 med målinger af planteprøver. Arbejdet fortsatte gennem 1960’erne med for eksempel radiografi af en menneskelig kiste25 eller rotter26, hvor brugen af kontrastmidler, såsom gadoliniumoxid (Gd2O3), blev undersøgt. Desuden blev det antaget, at kontrast i humant tumorvæv versus normalt væv skyldtes en lokal stigning i H-indhold. Under disse indledende forsøg blev det konkluderet, at øget neutronflux og rumlig opløsning ville forbedre kvaliteten af nR og sandsynligvis ville øge dens popularitet som en komplementær teknik til industrielle eller biomedicinske anvendelser. De seneste undersøgelser omfatter nR- og nCT-målinger udført på kræftvævsprøver1 og sektioner af dyreorganer 2,3,27 til biomedicinske og retsmedicinske anvendelser.
Beliggende på Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, er High Flux Isotope Reactor (HFIR) en kraftig neutronkilde, der producerer neutroner ved fissionsreaktion. Disse neutroner har energier i størrelsesordenen 2 MeV og “afkøles” i reaktorpuljen ved kinetiske reaktioner med tungt vand for at nå energier i størrelsesordenen 100-300 eV. Optimeringen af et neutroneksperiment, hvad enten det er spredning eller billeddannelse, starter med forståelsen af neutronkilden og strålelinjeegenskaber såsom dens stråleintensitet, energifordeling og effekten af baggrund (hurtige neutroner, forsinkede neutroner, gammastråler). I HFIR-kølestyrehallen, hvor billedstrålelinjen er placeret, “afkøles” neutroner yderligere ved kinetiske interaktioner med en flydende H-moderator. De transporteres derefter i et buet styresystem væk fra kildens synsfelt, hvilket eliminerer hurtige neutroner og gammaforurening. Som illustreret i figur 1 er CG-1D neutronbilleddannelsesstrålelinjen28,29 placeret på en kold guide, hvilket indebærer, at neutronenergiområdet varierer fra nogle få meV til nogle få titalls eV (i dette tilfælde de tilsvarende anvendelige neutronbølgelængdeområder fra 0,8 til 10 Å) med en flux i området 107 n / (cm2∙s) ved prøvepositionen. Et motoriseret blænde-/diffusorsystem definerer billeddannelsesinstrumentets pinholegeometri. Neutroner rejser en afstand på 6,59 m i et helium (He) fyldt flyverør med aluminium (Al) vinduer i hver ende. Flyrør bruges til at transportere neutroner, samtidig med at luftspredningen begrænses, således at tabet i stråleintensitet er minimalt. Til de målinger, der er beskrevet i dette manuskript, er diffusoren lavet af et 1 mm tykt 50 nm aluminiumoxid (Al2O3) nanopulver indkapslet i en Al-beholder. Diffusoren reducerer stråleartefakterne, der kommer fra neutronguiden (som forstørres af pinhole-geometrien i en billedstrålelinje), ellers er skarpe vandrette og lodrette intensitetsudsving synlige i røntgenbilledet, og normalisering af dataene bliver udfordrende. Til de eksperimenter, der er illustreret her, omdannes neutroner til lys ved hjælp af et 25 μm tykt lithium-6 fluorid/zinksulfidfosfor (6LiF/ZnS:Ag).
Optimering af kollimation afhænger af prøve-til-detektor-positionen, den krævede rumlige opløsning og anskaffelsestid. Når prøven sidder et par cm væk fra scintillatoren, giver høje kollimationer (L / D over 800, hvor L er afstanden fra pinhole-åbningen med diameter, D og detektoren) bedre rumlig opløsning på bekostning af neutronflux. Lav kollimation (L / D under 800) foretrækkes til in situ dynamiske undersøgelser, når tidsopløsning har forrang for rumlig opløsning. For målingerne beskrevet i dette manuskript var L/D og rumlig opløsning henholdsvis ca. 355 og 75 μm. Den tidsmæssige opløsning varierede afhængigt af signal-støj-forholdet (SNR). Prøven blev placeret så tæt på scintillator som muligt for at reducere geometrisk forvrængning såsom sløring. Oversættelses- og rotationstrin er tilgængelige for at indstille prøven tæt på detektorerne og udføre computertomografi (CT). CG-1D tilbyder tre typer detektorer: en ladningskoblet enhed (CCD) med 2048 pixels x 2048 pixels med en pixelhøjde på 13.5 μm, en videnskabelig komplementær metaloxid halvlederdetektor (sCMOS) med 2560 pixels x 2160 pixels med en pixelhøjde på 6.5μm og en mikrokanalpladedetektor (MCP)30,31 med 512 pixels x 512 pixels med en pixelstørrelse på 55μm. Spredte neutroner absorberes med ~5 mm tykt borgummi for at beskytte detektorchippen mod at se neutroner. Denne absorption genererer gammastråler, der kan stoppes af bly (Pb) placeret mellem borgummiet og detektoren. Hver detektor er optimeret til forskellige synsfeltopløsninger (FOV) samt rumlige opløsninger og tidsopløsninger. Til måling af rottelårben og muselunger blev CCD-detektoren brugt til sin store synsevne (~ 7 cm x 7 cm) og rimelige rumlige opløsning på ca. 75 μm. Planterod/jordsystemets nCT blev udført med sCMOS, da målet var at erhverve nCT’er så hurtigt som muligt på bekostning af FOV (som var begrænset til ~ 5 cm x 4,2 cm); Således led rumlig opløsning åbenbart. I disse detektorer omdannes neutroner enten til lys eller en alfa-partikel til detektionsformål. Rotation af prøven omkring sin lodrette akse og erhvervelse af røntgenbilleder i på hinanden følgende rotationsvinkler muliggør erhvervelse af nCT. Den 3-dimensionelle volumetriske gengivne model af prøven under undersøgelse opnås ved at bruge den interne iMARS3D python-baserede Jupyter filtreret-back-projection (FBP) notebook, pyMBIR eller en kommerciel software, alt beskrevet nedenfor.
Endelig opsamles neutroner, der ikke har interageret med prøven eller detektoren, i en strålestopposition ca. 1 m nedstrøms fra detektorsystemet for at minimere baggrundsstøj. CG-1D bjælkestoppet er 0,75 m bredt, 0,5 m højt og 35 mm tykt og lavet af B4C i epoxy. Strålestoppet er forstærket med 10 mm 95% beriget lithiumcarbonat (6Li2CO3) i en brandsikker epoxy, hvor neutronstrålen rammer, med et hulrum foret med 6Li, bly (Pb) og stål designet til at indeholde den høje hastighed af sekundære gammastråler. Bjælkestoppet er direkte fastgjort til bjælkelinjens stålafskærmningsvæg. Et fotografi af CG-1D-strålelinjen er vist i figur 2.
Tre rekonstruktionssoftware blev brugt til at rekonstruere de tre eksperimentelle data i henholdsvis 3D. Musens lungeprøve rekonstruktion blev udført ved hjælp af Octopus32, en kommerciel rekonstruktionssoftware, der bruger FBP. Octopus-software sidder på en server-pc og kan bruges til at rekonstruere data indsamlet ved beamline. En rekonstruktionssoftware, der hedder iMARS3D, er tilgængelig på CG-1D. Det er baseret på open source-koden TomoPY33 med tilføjede funktioner såsom automatiseret vippekorrektion, efterbehandlingsfiltre osv. iMARS3D omfatter forbehandling af dataene (subtraktion af baggrund og støj), beskæring, medianfiltrering (for at korrigere for gammaangreb og døde pixels), automatiseret korrektion af stråleintensitetsudsving og korrektion af prøvehældning. Når sinogrammer er oprettet, er yderligere databehandling såsom fjernelse og udjævning af ringartefakter en mulighed. De forskellige trin i rekonstruktionen gemmes på analyseserveren (og flyttes senere i den delte mappe med forslag), mens de endelige 2D-udsnit straks gemmes i den delte mappe med forslag. Rottelårbenet blev rekonstrueret ved hjælp af iMARS3D. Planterod/jordprøven blev forbehandlet ved medianfiltrering af dataene ved hjælp af TomoPY efterfulgt af hældningsaksekorrektion ved hjælp af Pythons SciPy-bibliotek. Rekonstruktionen blev udført ved hjælp af en python-pakke udviklet internt kaldet pyMBIR (bygget ved hjælp af kerner fra ASTRA-værktøjskassen34), som implementerer en række tomografiske algoritmer fra baseline FBP til avancerede modelbaserede iterative rekonstruktionsteknikker35, der kan opnå rekonstruktioner af høj kvalitet fra ekstremt sparsomme og støjende neutrondatasæt. Alle gengivne volumener baseret på ovennævnte rekonstruktionsværktøjer er repræsenteret i dæmpningskontrast. Al visualisering blev udført ved hjælp af den kommercielle visualiserings-, segmenterings- og dataanalysesoftwarepakke AMIRA36.
Dette manuskript har til formål at demonstrere proceduren for anvendelse af neutronbilleddannelse (nR og nCT) ved HFIR CG-1D-strålelinjen. Denne undersøgelse illustrerer også de nuværende state-of-the-art nR- og nCT-kapaciteter til biologiske prøver, specifikt en muselunge, en rotteknogle og planterods- / jordsystemer. Musens lunge blev valgt for at illustrere komplementariteten af neutroner til måling af lungevævet, mens røntgenstråler er mest følsomme over for knogler. Knogleprøven, en rottelårben, havde et titaniumimplantat (Ti), hvilket illustrerer kontrasten mellem knoglen og metallet og muligheden for at se grænsefladen mellem knogler og metal (hvilket er vanskeligt at måle med røntgenstråler, da metaller stærkt dæmper dem4). Endelig illustrerer planterodsvandsystemet nCT’s tredimensionelle (3D) evne til at måle rod-/jordsystemer in situ. Det viser desuden fordele / ulemper ved at bruge nR til biologiske prøver. Denne metode kan åbenbart sikkert bruges til at måle vanddynamikken i et planterodssystem, men kan ikke betragtes som en billeddannelsesteknik for levende dyr eller mennesker på grund af de risici, der er forbundet med strålingseksponering, hvilket begrænser undersøgelser til enten (døde) mus eller patologilignende målinger, hvor f.eks. en vævsprøve resekteres fra en patient (dyr eller menneske) og fremstilles ved fiksering, før den måles i en neutronstråle.
Neutronradiografi og CT af biologiske prøver er lovende billeddannelsesteknikker, der supplerer røntgenbilleddannelse eller magnetisk resonansbilleddannelse. De kritiske trin i udførelsen af et neutronbilleddannelseseksperiment af en biologisk prøve er relateret til dens forberedelse og dens indeslutning ved strålelinjen. Optimering af et eksperiment er drevet af det videnskabelige spørgsmål, der skal besvares. Hvis videnskabsspørgsmålet kræver høj rumlig opløsning for at observere et fænomen, kræves der lange erhvervelsestider, og ulempen ved nCT (med synsfelt i cm-størrelse) er, at det tager timer at udføre en scanning. Dette skyldes hovedsagelig forskellen i den samlede neutronflux, der er tilgængelig på en reaktor sammenlignet med en synkrotronkilde, hvor røntgen-CT-scanninger kan tage sekunder til minutter for et par mm2 synsfelt. Selv om metoden kan anvendes på ex vivo-vævsprøver udtaget fra dyr, kan den ikke udvides in vivo til levende dyr eller mennesker på grund af strålingseksponeringsrisikoen (såsom gammastråler produceret af neutroner og neutroninteraktioner med atomerne i prøven). Det er dog velegnet til billeddannelse af interaktioner mellem planter, rod og jord (figur 7), såsom vandoptagelsesdynamik.
Fordelen ved at bruge hurtig nCT til plantedynamik er følsomheden over for H i vand og fraværet af strålingsskader på planten, i modsætning til røntgen CT. Desuden kan der observeres unik kontrast ved brug af neutroner i knogle-/metalprøver såsom et rottelårben, hvor metallet er relativt gennemsigtigt sammenlignet med det omgivende væv (figur 5), hvilket potentielt undgår metalartefakter induceret af røntgen CT39. Dyrevæv, såsom muselunge (figur 6), viser imponerende påvisning af blødt vævsstruktur, fordi neutroner er følsomme over for H, men rumlig opløsning er noget den begrænsende faktor i disse målinger. Kontrast tilvejebringes af de H-atomer, der er til stede i biologiske prøver19,39.
Med fremskridtene inden for nye teknikker såsom neutrongitterinterferometri og forbedringen af rumlig opløsning (nogle få mikrometer er for nylig blevet rapporteret42,43) kan neutronbilleddannelse tilbyde endnu nye kontrastmekanismer for biologiske væv med forbedret rumlig opløsning. Udforskningen af højere energi neutroner (for at muliggøre målinger af tykke prøver) lover også evnen til at måle større dele af et animalsk væv, såsom en intakt mus, hvilket giver endnu nye muligheder for biomedicinsk forskning.
The authors have nothing to disclose.
En del af denne forskning udnyttede ressourcer på High Flux Isotope Reactor, der drives af ORNL, og sponsoreret af US Department of Energy, Office of Science, User Facilities, under kontrakt DE-AC05-00OR22725 med UT-Battelle, LLC. En del af denne forskning blev støttet af ORNL gennem Eugene Wigner Distinguished Staff Fellowship-programmet. Denne forskning blev også sponsoreret af DOE Office of Science, Office of Biological and Environmental Research. Rottelårbensprøver blev opnået fra eksperimenter udført i samarbejde med Dr. Rick Sumner ved Rush University Medical Center med finansiering opnået fra NIH (R01AR066562) og fra Orthopedic Research and Education Foundation-Smith og Nephew-prisen. Holdet ønsker at takke HFIR-supportholdene, der muliggør brugen af neutronspredningsstrålelinjerne.
Aluminum containers | custom | Made from aluminum plates or tubing (alternate is quartz), plant and mouse sample | |
Aluminum foil | Fisher | 01-213-100 | Mouse lung sample containment |
Deionized water or deuterium oxide | Water or D2O can be used to enhance contrast, plant sample | ||
Ethanol | Fisher | 04-355-223 | Mouse lung sample |
Gauze sponges | CardinalHealth | Fully submerged in phosphate-buffered saline (PBS) and used to wrap samples, rat femur sample | |
Growth chamber | Conviron | A1000 | Any growth chamber or greenhouse with controlled conditions would work, plant sample |
Laboratory balance | Weighing plant system can be used to measure actual water content in the soils, plant sample | ||
Pure silica sand | US Silica Co. | Flint#13 | Pure SiO2 provides low neutron attenuation compared to soils, plant sample |
Sprague-Dawley Rats | Harlan | Order Code: 002-US | Rat femur sample |
Titanium Rod | Goodfellow | TI007905 | Rat femur sample |