Visualisering av svarande möten med en antigenmärkt blockerande lesion
Summary
Medan replikationsgaffelkollisioner med DNA-addukter kan inducera dubbelsträngsbrott, är mindre känt om interaktionen mellan replisomer och blockerande lesioner. Vi har använt närhetsligeringsanalysen för att visualisera dessa möten och för att karakterisera konsekvenserna för svarande komposition.
Abstract
Betydande insikt finns i det cellulära svaret på dubbelsträngbrott (DSB), inducerade av nukleaser, strålning och andra DNA-brytare. Delvis återspeglar detta tillgången på metoder för identifiering av brytplatser och karakterisering av faktorer som rekryterats till DSB vid dessa sekvenser. DSB uppträder emellertid också som mellanprodukter under bearbetningen av DNA-addukter bildade av föreningar som inte direkt orsakar brott och inte reagerar vid specifika sekvensställen. Följaktligen är tekniker som möjliggör analys av bindningsinteraktioner med responsfaktorer och reparationsproteiner okända för de flesta av dessa medel. Till exempel kan DNA-interstrandtvärbindningar (ICL) provocera avbrott efter replikationsgaffelmöten. Även om det bildas av läkemedel som ofta används som cancerkemoterapeutika, har det inte funnits någon metod för att övervaka deras interaktioner med replikationsproteiner.
Här beskriver vi vår strategi för att följa det cellulära svaret på gaffelkollisioner med dessa utmanande addukter. Vi kopplade ett steroidantigen till psoralen, som bildar fotoaktiveringsberoende ICL i kärnor i levande celler. ICL: erna visualiserades genom immunofluorescens mot antigenmärket. Taggen kan också vara en partner i Proximity Ligation Assay (PLA) som rapporterar nära associering av två antigener. PLA utnyttjades för att skilja proteiner som var nära associerade med de märkta ICL: erna från de som inte var. Det var möjligt att definiera svarande proteiner som behölls efter möten med ICL och identifiera andra som förlorades. Detta tillvägagångssätt är tillämpligt på alla strukturer eller DNA-addukter som kan detekteras immunologiskt.
Introduction
Det cellulära svaret på dubbelsträngbrott är väl dokumenterat på grund av en följd av allt kraftfullare metoder för att rikta raster till specifika genomiska platser 1,2,3. Säkerheten på plats möjliggör entydig karakterisering av proteiner och andra faktorer som ackumuleras på platsen och deltar i DNA Damage Response (DDR) och därigenom driver de icke-homologa ändfogningsvägarna (NHEJ) och homolog rekombination (HR) som reparerar brott. Naturligtvis introduceras många pauser av medel som strålning och kemiska arter som inte attackerar specifika sekvenser4. För dessa finns det dock procedurer tillgängliga som kan konvertera ändarna till strukturer som är mottagliga för märkning och lokalisering 5,6. Avbrott introduceras också genom biologiska processer, såsom immunoglobulinomläggning, och ny teknik tillåter också lokalisering7. Förhållandet mellan svarande faktorer och dessa platser kan sedan bestämmas.
Avbrott uppträder också som en indirekt följd av addukter bildade av föreningar som inte är inneboende brytare men stör DNA-transaktioner som transkription och replikation. De kan bildas som en egenskap hos det cellulära svaret på dessa hinder, kanske under reparation eller för att de provocerar en struktur som är sårbar för nukleasattack. Vanligtvis är det fysiska förhållandet mellan addukten, pausen och föreningen med svarande faktorer inferentiell. Till exempel bildas ICL av kemoterapeutika såsom cisplatin och Mitomycin C8 och som en reaktionsprodukt av abasiska platser9. ICL är välkända som potenta block till replikationsgafflar10, vilket stoppar gafflar som kan klyvas av nukleaser11. Den kovalenta kopplingen mellan strängar lindras ofta av vägar som har obligatoriska brott som intermediärer 12,13, vilket kräver homolog rekombination för att återuppbygga replikationsgaffeln14. I de flesta experiment följer utredaren responsen av faktorer av intresse för de brott som bildas nedströms kollisionen mellan en replikationsgaffel och en ICL. Men eftersom det inte har funnits någon teknik för lokalisering av en provocerande lesion, kan närheten av svaret och dess beståndsdelar till ICL endast antas.
Vi har utvecklat en strategi för att möjliggöra analys av proteinföreningar med icke-sekvensspecifika kovalenta addukter, illustrerad här av ICL. I vårt system introduceras dessa av psoralen, en fotoaktiv naturlig produkt som använts i tusentals år som en terapeutisk behandling för hudsjukdomar15. Vårt tillvägagångssätt bygger på två viktiga egenskaper hos psoralener. Den första är deras höga frekvens av tvärbindningsbildning, som kan överstiga 90% av addukterna, i motsats till de mindre än 10% som bildas av populära föreningar såsom cisplatin eller Mitomycin C 8,16. Den andra är föreningens tillgänglighet till konjugering utan förlust av tvärbindningskapacitet. Vi har kovalent kopplat trimetyl psoralen till Digoxigenin (Dig), en sedan länge etablerad immunotag. Detta möjliggör detektion av psoralenaddukterna i genomiskt DNA genom immunfärgning av Dig-taggen och visualisering genom konventionell immunofluorescens17.
Detta reagens tillämpades, i vårt tidigare arbete, på analys av replikationsgaffelmöten med ICL med hjälp av en DNA-fiberbaserad analys16. I det arbetet fann vi att replikering kunde fortsätta förbi en intakt ICL. Detta var beroende av ATR-kinaset, som aktiveras av replikationsstress. Omstarten av replikeringen var oväntad med tanke på strukturen hos CMG-replikativ helikas. Detta består av MCM-heterohexameren (M) som bildar en offsetgapad ring runt mallsträngen för ledande strängsyntes som är låst av proteinerna i GINS-komplexet (G, bestående av PSF1, 2, 3 och SLD5) och CDC45 (C) 18. Förslaget att replikering skulle kunna återupptas på sidan av ICL distalt till sidan av den svarande kollisionen argumenterade för en förändring av svarets struktur. För att ta itu med frågan om vilka komponenter som var i svaret vid tidpunkten för mötet med en ICL utvecklade vi det tillvägagångssätt som beskrivs här. Vi utnyttjade Dig-taggen som partner i Proximity Ligation Assays (PLA)19 för att förhöra ICL: s nära samband med proteiner i repliken20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om PLA är en mycket kraftfull teknik finns det tekniska problem som måste lösas för att få tydliga och reproducerbara resultat. Antikropparna måste ha hög affinitet och specificitet. Dessutom är det viktigt att minska de ospecifika bakgrundssignalerna så mycket som möjligt. Vi har funnit att membran och cellulärt skräp bidrar till bakgrunden, och vi har tagit bort dem så mycket som möjligt. Tvätten med tvättmedel som innehåller buffertar före fixering och tvätten med metanol efter fixering bidrar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes delvis av NIH: s intramurala forskningsprogram, National Institute on Aging, USA (Z01-AG000746–08). J.H. stöds av National Natural Science Foundations of China (21708007 och 31871365).
Materials
| Alexa Fluor 568, Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10011 | 1 in 1000 |
| 35 mm plates with glass 1.5 coverslip | MatTek | P35-1.5-14-C | Glass Bottom Microwell Dishes 35mm Petri Dish Microwell |
| Alexa Fluor 488,Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Invitrogen | A-10001 | 1 in 1000 |
| Bovine serum albumin (BSA) | SeraCare | 1900-0012 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| CDC45 antibody (rabbit) | Abcam | ab126762 | 1 in 200 |
| Cell adhesive | Life Science | 354240 | for cell-TAK solution |
| Confocal microscope | Nikkon | Nikon TE2000 spinning disk microscope | equiped with Volocity software |
| Digoxigenin (Dig) antibody (mouse) | Abcam | ab420 | 1 in 200 |
| Dig-TMP | synthesized in the Seidman Lab | ||
| Duolink Amplification reagents (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82010 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ detection reagents | Sigma-Aldrich | DUO92007 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | anti-mouse MINUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ oligonucleotide PLA probe PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | anti-rabbit PLUS, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| Duolink in situ wash buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink Wash Buffers, reagents need to be stored at 4 °C |
| epifluorescent microscope | Zeiss | Axiovert 200M microscope | Equipped with the Axio Vision software packages (Zeiss, Germany) |
| Formaldehyde 16% | Fisher Scientific | PI28906 | for fix solution |
| Goat serum | Thermo | 31873 | Blocking solution, reagents need to be stored at 4 °C |
| Image analysis software | open source | Cell profiler | works for analysis of single plane images |
| Image analysis software-license required | Bitplane | Imaris | Cell Biology module needed. Can quantify PLA dots/nuclei in image stacks (3D) and do 3D reconstructions |
| Ligase (1 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82029 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Ligation reagent (5×) | Sigma-Aldrich | DUO82009 | reagents need to be stored at -20 °C |
| MCM2 antibody (rabbit) | Abcam | ab4461 | 1 in 200 |
| MCM5 antibody (rabbit monoclonal) | Abcam | Ab75975 | 1 in 1000 |
| Methanol | Lab ALLEY | A2076 | pre-cold at -20°C before use |
| phosphoMCM2S108 antibody (rabbit) | Abcam | ab109271 | 1 in 200 |
| Polymerase (10 unit/μl) | Sigma-Aldrich | DUO82030 | reagents need to be stored at -20 °C |
| Prolong gold mounting media with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36935 | |
| PSF1 antibody (rabbit) | Abcam | ab181112 | 1 in 200 |
| RNAse A 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | reagents need to be stored at 4 °C |
| Statistical analysis and data visualization software | open source | R studio | ggplot2 package for generation of dot plot and box plots |
| Statistical analysis and data visualization software-license required | Systat Software | Sigmaplot V13 | |
| TMP (trioxalen) | Sigma-Aldrich | T6137_1G | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787_250ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416_100ML | |
| UV box | Southern New England Ultraviolet | Discontinued. See Opsytec UV test chamber as a possible replacement | |
| UV test Chamber | Opsytec | UV TEST CHAMBER BS-04 | |
| VE-821 | Selleckchem | S8007 | final concentrtion is 1µM |
References
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096-8106 (1994).
- Wright, D. A., et al. Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nature Protocols. 1 (3), 1637-1652 (2006).
- Brinkman, E. K., et al. Kinetics and fidelity of the repair of Cas9-induced double-strand DNA breaks. Molecular Cell. 70 (5), 801-813 (2018).
- Vitor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Bioscience. 7, 24 (2020).
- Galbiati, A., Beausejour, C., d’Adda di, F. F. A novel single-cell method provides direct evidence of persistent DNA damage in senescent cells and aged mammalian tissues. Aging Cell. 16 (2), 422-427 (2017).
- Vitelli, V., et al. Recent Advancements in DNA damage-transcription crosstalk and high-resolution mapping of DNA breaks. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 87-113 (2017).
- Canela, A., et al. DNA breaks and end resection measured genome-wide by end sequencing. Molecular Cell. 63 (5), 898-911 (2016).
- Muniandy, P. A., Liu, J., Majumdar, A., Liu, S. T., Seidman, M. M. DNA interstrand crosslink repair in mammalian cells: step by step. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 45 (1), 23-49 (2010).
- Nejad, M. I., et al. Interstrand DNA cross-links derived from reaction of a 2-aminopurine residue with an abasic site. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1481-1489 (2019).
- Kottemann, M. C., Smogorzewska, A. Fanconi anaemia and the repair of Watson and Crick DNA crosslinks. Nature. 493 (7432), 356-363 (2013).
- Kaushal, S., Freudenreich, C. H. The role of fork stalling and DNA structures in causing chromosome fragility. Genes Chromosomes Cancer. 58 (5), 270-283 (2019).
- Knipscheer, P., Raschle, M., Scharer, O. D., Walter, J. C. Replication-coupled DNA interstrand cross-link repair in Xenopus egg extracts. Methods in Molecular Biology. 920, 221-243 (2012).
- Klein, D. D., et al. XPF-ERCC1 acts in Unhooking DNA interstrand crosslinks in cooperation with FANCD2 and FANCP/SLX4. Molecular Cell. 54 (3), 460-471 (2014).
- Long, D. T., Raschle, M., Joukov, V., Walter, J. C. Mechanism of RAD51-dependent DNA interstrand cross-link repair. Science. 333 (6038), 84-87 (2011).
- Benedetto, A. V. The psoralens. An historical perspective. Cutis. 20 (4), 469-471 (1977).
- Huang, J., et al. The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks. Molecular Cell. 52 (3), 434-446 (2013).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- O’Donnell, M. E., Li, H. The ring-shaped hexameric helicases that function at DNA replication forks. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 122-130 (2018).
- Koos, B., et al. Analysis of protein interactions in situ by proximity ligation assays. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 111-126 (2014).
- Huang, J., et al. Remodeling of Interstrand Crosslink Proximal Replisomes Is Dependent on ATR, FANCM, and FANCD2. Cell Reports. 27 (6), 1794-1808 (2019).
- Huang, J., et al. Single molecule analysis of laser localized psoralen adducts. Journal of Visualized Experiments. (122), e55541 (2017).
- Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase ATR: ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (10), 622-636 (2017).
- Cortez, D., Glick, G., Elledge, S. J. Minichromosome maintenance proteins are direct targets of the ATM and ATR checkpoint kinases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10078-10083 (2004).
- Ersoy, I., Bunyak, F., Chagin, V., Cardoso, M. C., Palaniappan, K. Segmentation and classification of cell cycle phases in fluorescence imaging. Medical Image Computing and Computer-Assisted. 12, 617-624 (2009).
- Zhao, J., Dynlacht, B., Imai, T., Hori, T., Harlow, E. Expression of NPAT, a novel substrate of cyclin E-CDK2, promotes S-phase entry. Genes & Development. 12 (4), 456-461 (1998).
