여기서 우리는 면역 능력 마우스의 피부와 구강에 있는 몇몇 유전자의 기능을 동시에 평가하기 위하여 자궁 배아 렌즈바이러스 주사에서 초음파 유도를 사용하여 생체 내 CRISPR/Cas9 검열 방법론을 기술합니다.
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이 논문에서
요약
초록
유전자 변형 마우스 모델 (GEMM)은 유전자 기능을 평가하고, 인간 질병을 모델링하고, 치료 방법을 평가하기 위한 전임상 모델로 봉사하는 데 중요한 역할을해 왔습니다. 그러나, 그들의 시간, 노동 및 비용 집약적인 성격은 유전자 기능의 체계적인 분석을 위한 그들의 유틸리티를 제한합니다. 최근 게놈 편집 기술의 발전은 이러한 한계를 극복하고 멀티플렉스및 신속한 방식으로 특정 마우스 기관 내에서 직접 특정 유전자 변류의 빠른 생성을 허용합니다. 여기서, 우리는 CRISPR/Cas9 기반 방법(정기적으로 간격이 있는 짧은 Palindromic 반복군)을 기술하여 마우스의 피부와 구강의 상피 내에서 수천 개의 유전자 녹아웃 클론을 생성하고 종양 억제기 유전자에 대한 생체 내 CRISPR 화면에서 직접 수행하는 데 필요한 단계를 자세히 설명하는 프로토콜을 제공합니다. 이러한 접근법은 조직 항상성 동안 또는 다양한 질병 환경에서 유전자의 생물학적 기능을 연구하기 위해 CRISPR 활성화 또는 CRISPR 불활성화와 같은 다른 기관 또는 기타 CRISPR/Cas9 기술에 적용될 수 있다.
서론
게놈 이후 시대에 암 연구를 위한 도전의 한은 인과 유전자 돌연변이를 위한 게놈 데이터의 광대 한 양을 채굴하고 치료적으로 표적으로 할 수 있는 유전자 네트워크에 있는 노드를 확인하는 것입니다. 생물 정보 학적 분석은 이러한 목표를 향해 대단히 도움이되었지만, 시험관 및 생체 내 모델에서 효율적인 확립은 생물학적 시스템과 질병 상태의 복잡성을 해독하고 약물 개발을 가능하게하는 전제 조건입니다. 기존의 형질전환 마우스 모델은 생체 암 유전학 연구를 위해 광범위하게 사용되었지만, 그들의 비용, 시간 및 노동 집약적 인 성격은 현대 유전체학에 의해 해명 된 수백 개의 putative cancer 유전자의 체계적인 분석을 크게 금지했습니다. 이 병목 현상을 극복하기 위하여는, 우리는 한 마우스의 피부와 구강에 있는 유전자의 수백의 기능 손실 돌연변이를 동시에 유도하고 연구하기 위하여 CRISPR/Cas9 (정규로 간격짧은 Palindromic 반복군집실) 유전자 편집 기술3와 자궁 주입 방법론1,2에서 이전에 확립된 초음파 유도를 결합했습니다.
여기에서 기술된 방법론은 배아일 E9.5에서 살아있는 마우스....
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프로토콜
이 프로토콜은 토론토 대학의 IACUC에 따라 승인및 수행되었습니다.
1. 풀링된 CRISPR 라이브러리의 설계 및 복제
- 브로드 인스티튜트 sgRNA 디자이너(https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) 또는 CHOPCHOP 서버(https://chopchop.cbu.uib.no)와 같은 자원으로부터 관심 있는 마우스 유전자를 대상으로 하는 4-5sgRNAs를 선택합니다. 예를 들어 Sanjana 외.9에서 동일한 수의 비타겟팅 sgRNA를 선택하여 동일한 크기의 비타겟팅 컨트롤 gRNA 라이브러리를 생성합니다.
- sgRNA 라이브러리를 구성하는 동안, 표적 기관 시스템에서 각 sgRNA에 대한 충분한 범위가 있는지 확인하십시오. 마우스 피부에 대해, E9.5의 표피는 ~150,000세포를 포함하는 단일 층이며, 대부분은 줄기 세포 용량4를갖는다. 렌티 바이러스 성 트랜스포션이 15-20%의 감염성 으로 발생하면 18,000-24,000세포만이 E9.5에서 변환됩니다. 그에 따라 실험을 확장합니다.
- 이러한 sgRNA 라....
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결과
도 1A는 단일 12k 또는 92k 올리고 칩에서 비용 효율적인 방식으로 여러 사용자 정의 CRISPR 라이브러리를 멀티플렉싱하기 위한 올리고뉴클레오티드의 설계를 나타낸다. sgRNA(파란색 코드)를 선택하면 올리고뉴클레오티드는 제한 부위(주황색 BsmBI) 및 라이브러리 특정 PCR 프라이머 쌍(녹색 색 코딩)으로 설계되었습니다. 여러 라이브러리는 단일 올리고 칩에서 멀티플렉스를 위한 프라이머 쌍의 고유한 조합을 사용하여 설계할 수 있습니다. PCR이 특정 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 라이브러리를 증폭할 때, 항상 물만 음의 제어를 포함하고 아가로즈 젤에 대한 모든 반응을 실행합니다. 네거티브 컨트롤 레인에는 100bp의 대역이 없어야 하며, 라이브러리 증폭 차선에는 단일 100bp 대역이 있어야 합니다. 밴드가 없는 경우 PCR 프라이머 쌍을 적절하게 선택해야 합니다. 도 1B는 복제된 라이브러리의 품질 관리 단계와 .......
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토론
CRISPR/Cas9 게놈 편집은 유전자 기능 및 세포 과정을 조사하기 위하여 시험관 내 및 생체 내 연구 결과에서 널리 이용되었습니다. 대부분의 생체 내 연구는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 세포를 동물 모델(동종 이식 또는 xenograft)으로 이식합니다. 이것은 암 유전학 및 세포 기능을 공부하는 강력한 도구이지만, 여전히 기본 조직 미세 환경이 부족하고 상처 및 / 또는 면역 반응을 유도 할 수 있습니다.
이러한 과제를 극복하기 위해, 여러 그룹은 지난 몇 년 동안 여러 멀티플렉스 자동 마우스 모델을 생성하는 생체 내 CRISPR 접근방식에서직접 개척했다15,16,17,18. 이 프로젝트는 일반적으로 아데노 관련 바이러스 (AAV)에 의존하.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 캐나다 보건 연구소 (CIHR 365252), Krembil 재단 및 온타리오 연구 우수 라운드 8 (RE08-065)의 프로젝트 보조금에 의해 지원되었습니다. 삼패스 쿠마르 로가나단은 캐나다 암 학회 펠로우십(BC-F-16#31919)의 수혜자입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.45 미크론 필터 | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k 또는 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm 세포 배양 플레이트 | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| 알칼리성 포스파타제 | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| 크롬 장 봉합사 | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy 혈액 및 조직 DNA 추출 키트 | Qiagen | 69506 | |
| Endura 전기 유능 세포 | Lucigen | 60242-1 | |
| 유리 모세 혈관 | Drummond | 3-000-203-G / X | |
| HEK293T 세포 | ATCC | CRL-3216 | |
| 고속 원심 분리기 | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB 한천 | Wisent 기술 | 800-011-LG | |
| 마이크로피펫 풀러 | Sutter Instrument | P97 | |
| 미네랄 오일 | Sigma | M5904 | |
| 미니 프렙 플라스미드 키트 | Frogga Bio | PDH300 | |
| 마우스 산소 마취 시스템 | Visual Sonics | ||
| Nanoject II 마이크로매니퓰레이터 | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 ( BsmBI)용 버퍼) | NEB | R0580L | |
| 바늘 깎이 | 기기 | BV-10 | |
| 올리고 정리 키트 | Zymo 연구 | D4060 | |
| PAGE 정제 일루미나 시퀀싱 프라이머 | IDT DNA | ||
| PEI (폴리에틸렌 이민) | 시그마 | 408727-100ML | |
| 퍼모 플라스트 모델링 점토 | |||
| 중앙 개구부가 있는 페트리디쉬 | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 중합효소 2x 마스터 믹스 | NEB | M0494L | |
| Qubit 형광 정량 | Invitrogen | Q33327 | |
| 반원형 실리콘 플러그 | 코닝 | ||
| 실리콘 멤브레인 | Visual Sonics | ||
| T4 DNA 리가제 | NEB | M0202L | |
| 초원심분리기 튜브 | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 초음파 시스템 | Visual Sonics |
참고문헌
- Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduct....
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재인쇄 및 허가
