ב Vivo CRISPR / Cas9 הקרנה בו זמנית להעריך תפקוד גנים בעור העכבר וחלל הפה
Summary
כאן אנו מתארים מתודולוגיית הקרנה מהירה וישירה vivo CRISPR /Cas9 באמצעות אולטרסאונד מונחה זריקות lentiviral עוברי הרחם כדי להעריך בו זמנית פונקציות של מספר גנים בעור וחלל הפה של עכברים immunocompetent.
Abstract
מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEMM) סייעו בהערכת תפקוד הגנים, מידול מחלות אנושיות, ושימשו מודל פרה-קולינרי להערכת אפיקים טיפוליים. עם זאת, האופי עתיר הזמן, העבודה והעלות שלהם מגביל את התועלת שלהם לניתוח שיטתי של תפקוד הגנים. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות לעריכת גנום מתגברת על מגבלות אלה ומאפשרת יצירה מהירה של הפרעות גנים ספציפיות ישירות בתוך איברי עכבר ספציפיים באופן מרובה פיקסלים ומהיר. כאן, אנו מתארים שיטה מבוססת CRISPR /Cas9 (מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר) כדי ליצור אלפי שיבוטים נוקאאוט גנים בתוך האפיתל של העור חלל הפה של עכברים, ולספק פרוטוקול המפרט את השלבים הדרושים כדי לבצע מסך ישיר vivo CRISPR עבור גנים מדכאי גידול. גישה זו יכולה להיות מיושמת על איברים אחרים או טכנולוגיות CRISPR/Cas9 אחרות כגון CRISPR-הפעלה או CRISPR-inactivation ללמוד את הפונקציה הביולוגית של גנים במהלך הומאוסטזיס רקמה או בהגדרות מחלה שונות.
Introduction
אחד האתגרים בחקר הסרטן בעידן הפוסט-גנומי הוא לכרות את הכמות העצומה של נתוני הגנום עבור מוטציות גנטיות סיבתיות ולזהות צמתים ברשת הגנים שניתן לסמן אותם כמטרה טיפולית. בעוד ניתוחים ביואינפורמטיים סייעו מאוד לקראת מטרות אלה, הקמת מודלים יעילים במבחנה וב-vivo היא תנאי מוקדם לפענוח המורכבות של מערכות ביולוגיות ומדינות מחלה ולאפשר פיתוח תרופות. בעוד מודלים קונבנציונליים של עכבר מהונדס שימשו בהרחבה למחקרים גנטיים של סרטן vivo, האופי שלהם עלות, זמן- ועבודה אינטנסיבית אסרה במידה רבה על ניתוח שיטתי של מאות גנים סרטניים putative נפרם על ידי גנומיקה מודרנית. כדי להתגבר על צוואר בקבוק זה, שילבנו אולטרסאונד הוקמה בעבר מונחה במתודולוגיית הזרקת הרחם1,2 עם CRISPR / Cas9 (מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר) טכנולוגיית עריכתגנים 3 בו זמנית לגרום וללמוד מוטציות אובדן תפקוד של מאות גנים בעור חלל הפה של עכבר אחד.
המתודולוגיה המתוארת כאן משתמשת בזריקות מונחות אולטרסאונד של lentiviruses מהונדסים לתוך חלל מי השפיר של עוברי עכבר חיים ביום העוברי E9.5. המטען העדני המכיל רכיבי CRISPR/Cas9 מתמר את האקטודרם בעל השכבות היחידות, אשר מאוחר יותר מעורר את האפיתל של העור וחלל הפה. העור מורכב מאפידרמיס חיצוני, ואחריו קרום מרתף ודרמיס. אפידרמיס הוא אפיתל מרובד המורכב משכבה פנימית בסיסית, השומרת על קשר עם קרום המרתף ויש לה יכולת רבייה ותא גזע. שכבת הבסיס מעוררת את השכבות המובחנות לעיל כגון שכבות קרנית ספיניות, פרטניות ושכבות2,4. מחקרי מעקב שושלת מראים כי שיטה ישירה זו ב- vivo CRISPR/Cas9 מבצעת מניפולציה גנטית בתאי גזע שוכני רקמות בתוך שכבת הבסיס הנמשכת לאורך כל הבגרות. כמו lentivirus ניתן titrated כדי לתמר את E9.5 פני השטח ectoderm בצפיפות שיבוט, שיטה זו יכולה לשמש כדי ליצור עכברי פסיפס מחסה אלפי שיבוטים נוק אאוט גן דיסקרטי. לאחר מכן ניתן להשתמש ברצף הדור הבא כדי לנתח את ההשפעה של אבלציה של גנים בתיווך CRISPR/Cas9 בתוך שיבוטים אלה באופן מרובה ערכים5.
לאחרונה השתמשנו בשיטה זו כדי להעריך את הפונקציה של 484 גנים המראים מוטציות חוזרות ונשנות בקרצינומה של תאי קשקש הראש והצוואר האנושיים (HNSCC)5. HNSCC הוא סרטן הרסני עם שיעור תמותה גבוה של 40-50% וזה הסרטןהשישי בשכיחותו בעולם6. HNSCC להתעורר רירית רירית של דרכי הנשימה העליונות או חלל הפה קשורים עם צריכת טבק ואלכוהול או זיהום וירוס הפפילומה האנושי (HPV). קרצינומה של תאי קשקש עוריים (SCC) הם גידולים בעור ומייצגים את הסרטן השני בשכיחותו בבני אדם7. SCC עורית ו HNSCC דומים מאוד מבחינה היסטולוגית מולקולרית, עם אחוז גבוה של מקרים המציגים שינוי TP53, PIK3CA, NOTCH1, ו HRAS8. אמנם יש רק קומץ גנים שעברו מוטציה בתדירות גבוהה, אך ישנם מאות גנים שנמצאו שעברו מוטציה בתדירות נמוכה (< 5%), תופעה הידועה בכינויה התפלגות הזנב הארוך. מכיוון שרוב הגנים ארוכי הזנב חסרים אימות ביולוגי או קליני, השתמשנו בטכנולוגיית ההקרנה in vivo CRISPR זו כדי מודל של אובדן תפקוד של גנים אלה בעכברים נוטים לגידולים עם מוטציות רגישות ב- p53, Pik3ca או Hras וזיהינו מספר גנים מדכאי גידולים חדשניים המשתפים פעולה עם p53, Pik3ca או Hras כדי לעורר התפתחות הגידול5.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט כדי ליצור ספריות sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA מרובות ולבצע CRISPR / Cas9 גנים לדפוק את המסכים באקטודרם משטח העכבר. שים לב, מתודולוגיה זו יכולה להיות מותאמת לשלב טכנולוגיות אחרות מניפולציה גנים כגון הפעלת CRISPR (CRISPRa) ו CRISPR איון (CRISPRi) או שונה כדי למקד מערכות איברים אחרות בעכבר ללמוד פונקציות גנים.
Protocol
Representative Results
Discussion
עריכת הגנום CRISPR/Cas9 הייתה בשימוש נרחב במחקרי הפריה חוץ גופית וב-vivo כדי לחקור תפקודי גנים ותהליכים תאיים. רוב מחקרי vivo משתמשים בתאים ערוכים בגן CRISPR/Cas9 המושתלים במודל של בעלי חיים (allograft או xenograft). אמנם זהו כלי רב עוצמה לחקר גנטיקה סרטן ותפקודים הסלולר, זה עדיין חסר microenvironment רקמה מקורית ועלול לע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק פרויקט מהמכון הקנדי לחקר הבריאות (CIHR 365252), קרן קרמביל וקרן המחקר של אונטריו סבב מצוינות מחקר 8 (RE08-065). סמפת קומאר לוגנאתן הוא מקבל מלגת האגודה הקנדית למלחמה בסרטן (BC-F-16#31919).
Materials
| 0.45 micron filter | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k or 92k oligo chip | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm cell culture plates | Corning | ||
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| Alkaline phosphatase | NEB | M0290L | |
| Amplicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| BsmBI | NEB | R0580L | |
| Chromic gut suture | Covidien | ||
| Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq) | Illumina | ||
| DNA-cleanup kit | Zymo Research | D4008 | |
| DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kit | Qiagen | 69506 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 60242-1 | |
| Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High-Speed Centrifuge | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| LB Agar | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P97 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Mini-prep plasmid Kit | Frogga Bio | PDH300 | |
| Mouse oxygen anaesthesia system | Visual Sonics | ||
| Nanoject II micromanipulator | Drummond | ||
| NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI) | NEB | R0580L | |
| Needle sharpener | Sutter Instrument | BV-10 | |
| Oligo cleanup kit | Zymo research | D4060 | |
| PAGE purified illumina sequencing primer | IDT DNA | ||
| PEI (polyethyleneimine) | Sigma | 408727-100ML | |
| Permoplast modeling clay | |||
| Petridish with central opening | Visual Sonics | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Q5 Polymerase 2x Master mix | NEB | M0494L | |
| Qubit Fluorometric Quantification | Invitrogen | Q33327 | |
| Semicircular Silicone plug | Corning | ||
| Silicone membrane | Visual Sonics | ||
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| Ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Vevo2000 ultrasound system | Visual Sonics |
References
- Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
- Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
- Beronja, S., et al. RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth. Nature. 501, 185-190 (2013).
- Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367, 1264-1269 (2020).
- Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).
- Green, A. C., Olsen, C. M. Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review. British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).
- Campbell, J. D., et al. pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas. Cell Reports. 23, 194-212 (2018).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784 (2014).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
- Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343, 309-313 (2014).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554 (2014).
- Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics. Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).
- Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).
- Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).
- Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Science Advances. 4, 5508 (2018).
- Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (151), e59780 (2019).
- Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163, 1515-1526 (2015).
