إعداد الخلايا الدهنية بروجينيتور من ماوس Epididymal الأنسجة الدهنية
Summary
نحن نقدم طريقة بسيطة لعزل الخلايا الدهنية الصالحة للحياة للغاية من منصات الدهون الظهارية الماوس باستخدام فرز الخلايا المنشطة الفلوريس.
Abstract
السمنة والاضطرابات الأيضية مثل مرض السكري, أمراض القلب, والسرطان, وترتبط جميع مع إعادة عرض الأنسجة الدهنية مثيرة. الخلايا الدهنية الدهنية (APCs) الأنسجة المقيمة تلعب دورا رئيسيا في الأنسجة الدهنية التوازن ويمكن أن تسهم في علم الأمراض الأنسجة. إن الاستخدام المتزايد لتكنولوجيات تحليل الخلايا المفردة – بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وبروتيوميكس أحادي الخلية – يحول مجال الخلايا الجذعية/السلفة من خلال السماح بحل غير مسبوق لتغيرات التعبير الخلوي الفردية في سياق التغيرات السكانية أو على نطاق الأنسجة. في هذه المقالة، ونحن نقدم بروتوكولات مفصلة لتشريح الماوس الأنسجة الدهنية الظهارية، وعزل الخلايا الدهنية واحدة مشتقة من الأنسجة، وتنفيذ الفلوريسنس تنشيط فرز الخلايا (FACS) لإثراء لSCA1+/ CD31 قابلة للحياة–/ CD45–/ Ter119– APCs. وستتيح هذه البروتوكولات للمحققين إعداد مراكز عالية الجودة من الكارود للأفراد مناسبة للتحليلات النهائية مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.
Introduction
يلعب النسيج الدهني دورًا رئيسيًا في استقلاب الطاقة. يتم تخزين الطاقة الزائدة في شكل الدهون، والأنسجة الدهنية قادرة على التوسع أو التراجع كبيرة اعتمادا على الوضع الغذائي والطلب النشط. يمكن أن ينتج توسع الأنسجة الدهنية عن زيادة حجم الخلايا الشحمية (تضخم) و/أو من زيادة في عدد الخلايا الدهنية (فرط التنسج)؛ العملية الأخيرة ينظمها بإحكام انتشار وتمايز الخلايا السلف الدهنية1,2. خلال السمنة، الأنسجة الدهنية يتوسع بشكل مفرط، والخلل الوظيفي الأنسجة – بما في ذلك نقص الأكسجة, التهاب, ومقاومة الأنسولين – غالبا ما يتطور3,4. هذه المضاعفات هي عوامل الخطر للعديد من الأمراض المزمنة بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم والسكري وأمراض القلب والأوعية الدموية والسكتة الدماغية والسرطان5. وبالتالي، الحد من توسع الأنسجة الدهنية غير المنضبط وتخفيف أمراض الأنسجة الدهنية هي أعلى أولويات البحوث الطبية الحيوية. خلال توسع الأنسجة الدهنية ، يتكاثر الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية المقيمة (ASCs) ويميز بشكل متسلسل إلى preadipocytes (الخلايا السلف الملتزمة) ثم إلى الخلايا الدهنية الناضجة6. تظهر الدراسات الحديثة أحادية الخلية RNA تسلسل (scRNA-seq) أن هذه الخلايا السلف الدهنية (APC) السكان (ASCs وpreadipocytes) تظهر التجانس الجزيئي والوظيفية كبيرة7,8,9,10,11,12. على سبيل المثال، تعرض ASCs قدرة تمايز adipogenic مخفضة، في حين تظهر أيضًا قدرات أعلى للانتشار والتوسع، مقارنة بـ preadipocytes7. يتم الإبلاغ عن مزيد من الاختلافات الجزيئية داخل ASC والسكان preadipocyte، على الرغم من أن الأهمية الوظيفية لهذه الاختلافات لا تزال غير واضحة7. وتبرز هذه البيانات مجتمعة تعقيد تجمع الخلايا السلف الدهنية وتؤكد على الحاجة إلى تطوير وتوحيد الأدوات لتحسين فهم ومعالجة هذه التجمعات السكانية الحرجة من الخلايا.
هذا البروتوكول تفاصيل عزل Sca1 قابلية عاليةللحياة + مجموعات الخلايا السلف الدهنية من الماوس منصات الدهون الظهارية التي هي مناسبة لتحليلات المتلقين للحساسية، بما في ذلك دراسات الخلية المفردة (scRNA التسلسل) وثقافة الخلية. تم إجراء عزل وتفكك منصات الدهون الظهارية كما سبق وصفها7,13 مع تعديلات طفيفة تحسن من صلاحية الـ APCs المعزولة. باختصار، تلطخ الخلايا المنفصلة من منصات الدهون الظهارية بالأجسام المضادة ضد Sca1، وهي علامة لكل من ASCs وpreadipocytes6و7وعلامات النسب الأخرى (Lin): Ter119 (الخلايا الإريثرويدية)، CD31 (الخلايا البطانية)، وD45 (الكريات البيض). سكا 1 قابلة للحياة+/ Ter119–/ CD31–/ CD45–/ DAPI– ثم يتم فرز الخلايا من قبل فرز الخلايا المنشطة الفلورة (FACS). الأهم من ذلك، تم التحقق من صحة هذا البروتوكول من خلال عزل ناجحة وتحليل Sca1+/Lin– الخلايا السلف الدهنية ذكرت في دراسة حديثة تسلسل RNA خلية واحدة التي حددت الاكتظاظ الفرعي غير متجانسة وظيفيا داخل ASCs و preadipocytes7.
Protocol
Representative Results
Discussion
تسلسل RNA خلية واحدة (scRNA-seq) تكتسب بسرعة الجر كأداة قوية لدراسة في وقت واحد مجموعات الخلايا المتنوعة على مستوى الخلية الواحدة. نظراً لارتفاع التكاليف المرتبطة بإعداد العينة وتسلسل الإنتاجية العالية، لا بد من تحسين المدخلات الخلوية (قابلية البقاء العالية والنقاء) لزيادة احتمال النجاح التجر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقر بمرفق تحليل الخلايا المجهرية من Mayo Clinic (مايو كلينك) لتحليل التدفق الخلوي الأساسي للحصول على المساعدة في فرز FACS.
Materials
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
- Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
- Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. Obesity as a Disease. Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
- Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
- Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
- De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
- Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219 (2020).
- Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057 (2018).
- Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).
