Подготовка адипозы Клетки-предшественники из мыши Эпидидимальные жировые ткани
Summary
Мы представляем простой метод, чтобы изолировать весьма жизнеспособные клетки-предшественники жировой клетки из мыши эпидидимальных жировых подушечек с помощью флуоресценции активированной сортировки клеток.
Abstract
Ожирение и нарушения обмена веществ, такие как диабет, болезни сердца и рак, все связаны с драматическим жировой ткани ремоделирования. Ткань-резидент жировой клетки-предшественники (АПК) играют ключевую роль в жировой ткани гомеостаза и может способствовать патологии тканей. Растущее использование технологий анализа одноклеточных клеток, включая одноклеточное РНК-секвенирование и одноклеточную протеомику, преобразует поле стволовых/прагениторных клеток, позволяя беспрецедентное разрешение отдельных изменений экспрессии клеток в контексте демографических или тканевых изменений. В этой статье мы предоставляем подробные протоколы для вскрытия эпидидимальной жировой ткани мыши, изолируем одиночные клетки, полученные из жировой ткани, и выполняем флуоресценцию активированной клеточной сортировки (FACS) для обогащения для жизнеспособногоSca1/CD31–/CD45–/Ter119– БТР. Эти протоколы позволят следователям подготовить высококачественные БТР, пригодные для анализа ниже по течению, такие как секвенирование одноклеточной РНК.
Introduction
Жировая ткань играет ключевую роль в энергетическом метаболизме. Избыток энергии хранится в виде липидов, а жировая ткань способна значительно расшириться или опровержения в зависимости от питательного статуса и энергетического спроса. Расширение жировой ткани может быть результатом увеличения размера адипоцитов (гипертрофия) и/или увеличения числа адипоцитов (гиперплазия); последний процесс жестко регулируется пролиферацию и дифференциацию жировых клеток-предшественников1,2. Во время ожирения жировая ткань чрезмерно расширяется, а дисфункция тканей, включая гипоксию, воспаление и резистентность кинсулину, часто развивается 3,4. Эти осложнения являются факторами риска многих хронических заболеваний, включая гипертонию, диабет, сердечно-сосудистые заболевания, инсульт ирак 5. Таким образом, ограничение неконтролируемого расширения жировой ткани и смягчение патологий жировой ткани являются главными приоритетами биомедицинских исследований. Во время расширения жировой ткани, резидентов жировой ткани полученных стволовых клеток (ASCs) размножаются и дифференцировать последовательно в preadipocytes (совершенные клетки-предшественники), а затем в зрелые адипоциты6. Недавние одноклеточные РНК-секвенирования (scRNA-seq) исследованияпоказывают,что эти жировые клетки-предшественники (APC) популяций (ASCs и preadipocytes) обладают существенной молекулярнойи функциональной неоднородностью 7,8,9,10,11,12. Например, ASCs отображают уменьшенную адипогенную способность дифференциации, в то же время показывая более высокие возможности распространения и расширения, по сравнению с предадипоцитами7. Дальнейшие молекулярные различия сообщаются в популяциях ASC и preadipocyte, хотя функциональная актуальность этих различий остается неясной7. Вместе эти данные подчеркивают сложность жирового пула клеток-предшественников и подчеркивают необходимость разработки и стандартизации инструментов для лучшего понимания и управления этими критическими популяциями клеток.
В этом протоколе подробно рассматривается изоляция высокой жизнеспособности Sca1– жировых популяций клеток-предшественников от эпидидимальных жировых прокладок мыши, которые подходят для чувствительных анализов ниже по течению, включая одноклеточные исследования (секвенирование секвенирования) и клеточной культуры. Изоляция и диссоциация эпидидимальных жировых прокладокбыла выполнена, как описано ранее 7,13 с небольшими изменениями, которые улучшают жизнеспособность изолированных БТР. Короче говоря, диссоциированные клетки от эпидидимальных жировых подушечек окрашены антителами против Sca1, маркером как дляASCs,так и дляпредадипоцитов 6,7и других маркеров линии (Lin): Ter119 (эритроидные клетки), CD31 (эндотелиальные клетки) и CD45 (лейкоциты). ЖизнеспособныйSca1/Ter119–/CD31–/CD45–/DAPI– клетки затем сортируются по флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS). Важно отметить, что этот протокол был подтвержден успешной изоляции и анализа жизнеспособныхSca1/Lin – жировыеклетки-предшественники сообщили в недавнем исследовании секвенирования одноклеточной РНК, которые определили функционально неоднородных субпопуляций в ASCs и preadipocytes7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одноклеточное секвенирование РНК (scRNA-seq) быстро набирает обороты в качестве мощного инструмента для одновременного изучения различных популяций клеток на уровне одной клетки. Из-за высоких затрат, связанных с подготовкой образца и высокой пропускной способностью секвенирования, край…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем, клиники Майо микроскопии клеточного анализа основного потока цитометрии фонда за помощь в сортировке FACS.
Materials
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
- Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
- Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. Obesity as a Disease. Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
- Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
- Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
- De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
- Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219 (2020).
- Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057 (2018).
- Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).
