Preparación de células progenitoras adiposas de tejidos adiposos epidídicos del ratón
Summary
Presentamos un método simple para aislar células progenitoras adiposas altamente viables de las almohadillas de grasa epidídmica del ratón usando clasificación celular activada por fluorescencia.
Abstract
La obesidad y los trastornos metabólicos como la diabetes, las enfermedades cardíacas y el cáncer están asociados con la remodelación dramática del tejido adiposo. Las células progenitoras adiposas residentes en tejidos (APC) desempeñan un papel clave en la homeostasis del tejido adiposo y pueden contribuir a la patología tisular. El creciente uso de tecnologías de análisis unicelular ,incluida la secuenciación de ARN unicelular y la proteómica unicelular, está transformando el campo celular madre/progenitor al permitir una resolución sin precedentes de los cambios en la expresión celular individual en el contexto de cambios en toda la población o en todo el tejido. En este artículo, proporcionamos protocolos detallados para diseccionar el tejido adiposo epidídmico del ratón, aislar células derivadas de tejido adiposo único y realizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para enriquecer para Sca1viable +/CD31–/CD45–/Ter119– APCs. Estos protocolos permitirán a los investigadores preparar APCs de alta calidad adecuados para análisis posteriores, como la secuenciación de ARN de una sola célula.
Introduction
El tejido adiposo desempeña un papel clave en el metabolismo energético. El exceso de energía se almacena en forma de lípidos, y el tejido adiposo es capaz de expansión o retracción significativa dependiendo del estado nutricional y la demanda energética. La expansión del tejido adiposo puede ser el resultado de un aumento en el tamaño de los adipocitos (hipertrofia) y/o de un aumento en el número de adipocitos (hiperplasia); este último proceso estrictamente regulado por la proliferación y diferenciación de las células progenitoras adiposas1,2. Durante la obesidad, el tejido adiposo se expande excesivamente, y la disfunción tisular – incluyendo hipoxia, inflamación y resistencia a la insulina – a menudo desarrolla3,4. Estas complicaciones son factores de riesgo para muchas enfermedades crónicas como hipertensión, diabetes, enfermedades cardiovasculares, accidente cerebrovascular y cáncer5. Por lo tanto, limitar la expansión incontrolada del tejido adiposo y mitigar las patologías del tejido adiposo son las principales prioridades de investigación biomédica. Durante la expansión del tejido adiposo, las células madre derivadas del tejido adiposo residentes (ASC) proliferan y diferencian secuencialmente en preadipocitos (células progenitoras comprometidas) y luego en adipocitos maduros6. Estudios recientes de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) muestran que estas poblaciones de células progenitoras adiposas (APC) (ASC y preadipocitos) exhiben heterogeneidad molecular y funcional sustancial7,8,9,10,11,12. Por ejemplo, los ASC muestran una capacidad de diferenciación adipogénica reducida, al tiempo que exhiben mayores capacidades de proliferación y expansión, en comparación con los preadipocitos7. Se notifican nuevas diferencias moleculares en las poblaciones de ASC y preadipocitos, aunque la relevancia funcional de estas diferencias sigue sin estar clara7. Juntos, estos datos resaltan la complejidad del grupo de células progenitoras adiposas y subrayan la necesidad de desarrollar y estandarizar herramientas para comprender y manipular mejor estas poblaciones celulares críticas.
Este protocolo detalla el aislamiento de la alta viabilidad Sca1+ poblaciones de células progenitoras adiposas de almohadillas de grasa epidídmica del ratón que son adecuadas para análisis sensibles aguas abajo, incluyendo estudios unicelulares (secuenciación de SCRNA) y cultivo celular. El aislamiento y la disociación de las almohadillas de grasa epidídmica se realizaron como se describió anteriormente7,13 con ligeras modificaciones que mejoran la viabilidad de los APCs aislados. En resumen, las células disociadas de las almohadillas de grasa epidídmica están manchadas con anticuerpos contra Sca1, un marcador tanto para ASC como para preadipocitos6,7,y otros marcadores de linaje (Lin): Ter119 (células eritroides), CD31 (células endoteliales) y CD45 (leucocitos). Viable Sca1+/Ter119–/CD31–/CD45–/DAPI– las células se ordenan por la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Es importante destacar que este protocolo fue validado por el aislamiento y análisis exitosos de células progenitoras Sca1+/Linviables – adiposas notificadas en un estudio reciente de secuenciación de ARN de una sola célula que identificó subpoblaciones funcionalmente heterogéneas dentro de ASC y preadipocitos7.
Protocol
Representative Results
Discussion
La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) está ganando rápidamente tracción como una poderosa herramienta para estudiar simultáneamente diversas poblaciones celulares a nivel de una sola célula. Debido a los altos costos asociados con la preparación de muestras y la secuenciación de alto rendimiento, es imperativo optimizar las entradas celulares (alta viabilidad y pureza) para aumentar la probabilidad de éxito experimental. Algunos protocolos de preparación celular se basan en la eliminación de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos el Centro de Citometría de Flujo de Flujo de Núcleo de Análisis celular microscopía de Mayo Clinic para obtener ayuda con la clasificación de FACS.
Materials
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
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