Beredning av fett stamceller från mus epididymal fettvävnader
Summary
Vi presenterar en enkel metod för att isolera mycket livskraftiga fett stamceller från mus epididymal fettkuddar med fluorescens aktiverad cell sortering.
Abstract
Fetma och metabola störningar som diabetes, hjärtsjukdomar och cancer är alla förknippade med dramatisk fettvävnadsrenovering. Vävnad-bosatta fett stamceller (APCs) spelar en nyckelroll i fettvävnad homeostas och kan bidra till vävnad patologi. Den ökande användningen av encellsanalysteknik – inklusive encellig RNA-sekvensering och encellig proteomik – förändrar stam-/stamcellsfältet genom att tillåta oöverträffad upplösning av individuella celluttrycksförändringar inom ramen för förändringar i populationen eller vävnaden. I den här artikeln tillhandahåller vi detaljerade protokoll för att dissekera mus epididymal fettvävnad, isolera enstaka fettvävnad-härledda celler och utföra fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att berika för livskraftig Sca1+/ CD31–/ CD45–/ Ter119– APCs. Dessa protokoll kommer att göra det möjligt för utredare att förbereda högkvalitativa API: er som är lämpliga för nedströmsanalyser som RNA-sekvensering med en cell.
Introduction
Fettvävnad spelar en nyckelroll i energimetabolismen. Överskott av energi lagras i form av lipider, och fettvävnad kan betydande expansion eller upprullning beroende på näringsstatus och energisk efterfrågan. Expansion av fettvävnad kan bero på en ökning av fettstorleken (hypertrofi) och/eller av en ökning av adipocytnumret (hyperplasi); den senare processen regleras tätt genom spridning och differentiering av fettavkompitorceller1,2. Under fetma expanderar fettvävnad överdrivet, och vävnadsdysfunktion – inklusive hypoxi, inflammation och insulinresistens – utvecklasofta 3,4. Dessa komplikationer är riskfaktorer för många kroniska sjukdomar inklusive högt blodtryck, diabetes, hjärt-kärlsjukdomar, stroke och cancer5. Att begränsa okontrollerad fettvävnadsexpansion och mildra fettvävnadspatologier är därför högsta biomedicinska forskningsprioriteringar. Under fettvävnad expansion, bosatta fettvävnad-härledda stamceller (ASCs) proliferate och differentiera sekventiellt i preadipocytes (engagerade stamceller) och sedan i mogna adipocyter6. Nyligen genomförda encelliga RNA-sekvensering (scRNA-seq) studier visar att dessa fett stamceller (APC) populationer (ASCs och preadipocytes) uppvisar betydande molekylär och funktionell heterogenitet7,8,9,10,11,12. Till exempel visar ASCs en minskad adipogenic differentieringskapacitet, samtidigt som de uppvisar högre spridnings- och expansionskapacitet, jämfört med preadipocyter7. Ytterligare molekylära skillnader rapporteras inom ASC och preadipocyte populationer, även om funktionell relevans av dessa skillnader är fortfarande oklart7. Tillsammans belyser dessa data komplexiteten i fett stamcellspoolen och understryker behovet av att utveckla och standardisera verktyg för att bättre förstå och manipulera dessa kritiska cellpopulationer.
Detta protokoll beskriver isoleringen av hög lönsamhet Sca1+ fett stamceller populationer från mus epididymal fettkuddar som är lämpliga för känsliga nedströms analyser, inklusive encelliga studier (scRNA-sekvensering) och cell kultur. Isolering och dissociation av epididymala fettkuddar utfördes som tidigarebeskrivits 7,13 med små modifieringar som förbättrar livskraften hos isolerade API: er. I korthet färgas dissocierade celler från epididymala fettkuddar med antikroppar mot Sca1, en markör för både ASCs och preadipocyter6,7och andra härstamningsmarkörer (Lin) : Ter119 (erytroida celler), CD31 (endotelceller) och CD45 (leukocyter). Livskraftiga Sca1+/Ter119–/CD31–/CD45–/DAPI– celler sorteras sedan efter fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Viktigt, detta protokoll validerades genom framgångsrik isolering och analys av livskraftiga Sca1+/ Lin– fett stamceller rapporteras i en nyligen encellig RNA sekvensering studie som identifierade funktionellt heterogena subpopulationer inom ASCs och preadipocytes7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enkelcellig RNA-sekvensering (scRNA-seq) får snabbt dragkraft som ett kraftfullt verktyg för att samtidigt studera olika cellpopulationer på encellsnivå. På grund av höga kostnader i samband med provberedning och hög genomströmningssekvensering är det absolut nödvändigt att optimera cellulära ingångar (hög livskraft och renhet) för att öka sannolikheten för experimentell framgång. Vissa cellberedningsprotokoll förlitar sig på avlägsnande av döda celler och skräp med lågspinntvättar och kolumnbase…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi bekräftar Mayo Clinic Microscopy Cell Analysis Core Flow Cytometry Facility för hjälp med FACS sortering.
Materials
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
- Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
- Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. Obesity as a Disease. Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
- Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
- Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
- De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
- Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219 (2020).
- Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057 (2018).
- Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).
