בידוד של היסטון מרקמת עלה דורה עבור פרופיל ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה של סמנים אפיגנטיים פוטנציאליים
Summary
הפרוטוקול פותח כדי לחלץ ביעילות היסטונים שלמים מחומרי עלה דורה ליצירת פרופיל של שינויים פוסט-תרגומיים של היסטון שיכולים לשמש כסמנים אפיגנטיים פוטנציאליים כדי לסייע בהנדסת יבולים עמידים לבצורת.
Abstract
ההיסטונים שייכים למשפחה של חלבונים שמורים מאוד באיקריוטים. הם אורזים דנ”א לגרעין כיחידות תפקודיות של כרומטין. שינויים פוסט-תרגומיים (PTMs) של היסטונים, שהם דינמיים ביותר וניתן להוסיף או להסירם על ידי אנזימים, ממלאים תפקידים קריטיים בוויסות ביטוי גנים. בצמחים, גורמים אפיגנטיים, כולל PTMs היסטון, קשורים לתגובות הסתגלות שלהם לסביבה. הבנת המנגנונים המולקולריים של בקרה אפיגנטית יכולה להביא הזדמנויות חסרות תקדים לפתרונות הנדסה ביולוגית חדשניים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לבודד את הגרעינים ולטהר היסטונים מרקמת עלה דורה. ההיסטונים שחולצו ניתן לנתח בצורות שלמות שלהם על ידי ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה (MS) יחד עם כרומטוגרפיה נוזלית הפוכה מקוונת (RP) נוזלית (LC). שילובים stoichiometry של PTMs מרובים על אותו פרוטאופורם היסטון ניתן לזהות בקלות. בנוסף, גזירת זנב histone ניתן לזהות באמצעות זרימת העבודה מלמעלה למטה LC-MS, ובכך, מניב את הפרופיל הגלובלי PTM של היסטונים הליבה (H4, H2A, H2B, H3). יישמנו פרוטוקול זה בעבר כדי פרופיל PTMs histone מרקמת עלה דורה שנאספו ממחקר שדה בקנה מידה גדול, שמטרתו לזהות סמנים אפיגנטיים של עמידות לבצורת. הפרוטוקול יכול להיות מותאם וממוטב עבור כרומטין immunoprecipitation-רצף (ChIP-seq), או לחקר PTMs היסטון בצמחים דומים.
Introduction
החומרה הגוברת ותדירות הבצורת צפוי להשפיע על הפרודוקטיביות של גידולי דגנים1,2. דורה היא יבול מזון ואנרגיה דגנים הידוע ביכולתו יוצאת הדופן לעמוד בתנאים מגבילים מים3,4. אנו רודפים אחר הבנה מכנית של יחסי הגומלין בין מתח בצורת, פיתוח צמחים, ואפיגנטיקה של דורה[דורה bicolor (L. ) Moench] צמחים. העבודה הקודמת שלנו הוכיחה קשרים חזקים בין מיקרוביום צמחים וריזוספירה בהסתגלות בצורת ותגובות ברמה המולקולרית5,6,7. מחקר זה יסלול את הדרך לניצול הנדסה אפיגנטית בהתאמת היבולים לתרחישי אקלים עתידיים. כחלק מהמאמצים בהבנת האפיגנטיקה, אנו שואפים לחקור סמני חלבון המשפיעים על ביטוי הגנים בתוך האורגניזם הצמחי.
היסטונים שייכים למשפחה שמורה מאוד של חלבונים באיקריוטים שאורזים דנ”א לגרעין כיחידות בסיסיות של כרומטין. שינויים פוסט-תרגומיים (PTMs) של ההיסטונים מוסדרים באופן דינמי כדי לשלוט במבנה הכרומטין ולהשפיע על ביטוי הגנים. כמו גורמים אפיגנטיים אחרים, כולל מתילציה DNA, PTMs היסטון לשחק תפקידים חשובים בתהליכים ביולוגיים רבים8,9. מבחנים מבוססי נוגדנים כגון כתמים מערביים שימשו באופן נרחב כדי לזהות ולכמת PTMs היסטון. בנוסף, האינטראקציה של PTMs היסטון ו- DNA ניתן לבדוק ביעילות על ידי חיסוניות כרומטין – רצף (ChIP-seq)10. ב ChIP-seq, כרומטין עם PTM היסטון ממוקד ספציפי מועשר על ידי נוגדנים נגד PTM ספציפי. לאחר מכן, שברי הדנ”א יכולים להשתחרר מהכרומטין המועשר ולרצף אותו. אזורים של גנים המקיימים אינטראקציה עם PTM היסטון ממוקד מתגלים. עם זאת, כל הניסויים האלה מסתמכים במידה רבה על נוגדנים באיכות גבוהה. עבור כמה גרסאות histone / homologs או שילובים של PTMs, פיתוח של נוגדנים חזקים יכול להיות מאתגר מאוד (במיוחד עבור PTMs מרובים). בנוסף, נוגדנים יכולים להיות מפותחים רק אם PTM histone ממוקד ידוע. 11 לכן, שיטות חלופיות עבור untargeted, פרופיל גלובלי של PTMs היסטון נחוצים.
ספקטרומטריית מסה (MS) היא שיטה משלימה לאפיון PTMs היסטון, כולל PTMs לא ידוע עבורו נוגדנים אינם זמינים11,12. זרימת העבודה המבוססת היטב של MS “מלמטה למעלה” משתמשת בפרוטאזות כדי לעכל חלבונים לפפטידים קטנים לפני הפרדת כרומטוגרפיה נוזלית (LC) וזיהוי טרשת נפוצה. מכיוון שלהיסטונים יש מספר גדול של שאריות בסיסיות (ליצין וארגנין), עיכול טריפסין (פרוטאז ספציפי לליצין וארגנין) בזרימת העבודה הסטנדרטית מלמטה למעלה חותך את החלבונים לפפטידים קצרים מאוד. פפטידים קצרים קשה מבחינה טכנית לנתח על ידי LC-MS סטנדרטי, ואינם משמרים את המידע על הקישוריות ואת stoichiometry של PTMs מרובים. השימוש באנזימים אחרים או תיוג כימי לחסימת ליצינים יוצר פפטידים ארוכים יותר המתאימים יותר לאפיון של PTMs היסטון13,14.
לחלופין, ניתן להשמיט לחלוטין את שלב העיכול. בגישה זו “מלמעלה למטה”, יוני חלבון שלמים הם הציגו לתוך MS על ידי יינון electrospray (ESI) לאחר הפרדת LC באינטרנט, מניב יונים של פרוטאופורות histone שלמים. בנוסף, יונים (כלומר, פרוטאופורות) של עניין ניתן לבודד ולפצל בספקטרומטר המסה כדי להניב את יוני הרצף לזיהוי לוקליזציה PTM. לפיכך, טרשת נפוצה מלמעלה למטה יש את היתרון כדי לשמר את המידע ברמת proteoform וללכוד את הקישוריות של PTMs מרובים וקטעי מסוף על אותו proteoform15,16. ניסויים מלמעלה למטה יכולים גם לספק מידע כמותי ולהציע תובנות של סמנים ביולוגיים ברמת החלבון שלם17. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לחלץ היסטון מעלה דורה ולנתח את ההיסטונים שלמים על ידי LC-MS מלמעלה למטה.
הנתונים לדוגמה המוצגים באיור 1 ובאיור 2 הם של עלה דורה שנאסף בשבוע 2 לאחר השתילה. למרות שצפויה וריאציה של תשואה, פרוטוקול זה הוא בדרך כלל אגנוסטי לתנאי מדגם ספציפיים. אותו פרוטוקול שימש בהצלחה עבור רקמת עלה צמח דורה שנאספו מ 2, 3, 5, 8, 9, ו 10 שבועות לאחר השתילה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המוצג מתאר כיצד לחלץ היסטונים מדגימות עלה דורה (או בדרך כלל עלה צמחי). התשואה הממוצעת של היסטון צפויה להיות 2-20 מיקרוגרם לכל חומר עלה דורה 4-5 גרם. החומרים טהורים מספיק לניתוח היסטון במורד הזרם על ידי LC-MS (בעיקר היסטון עם זיהום חלבון ריבוזומלי ~ 20%). ניתן להשיג תשואה נמוכה יותר עקב ורי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לרונלד מור ותומאס פילמור על שעזרו בניסויי ספקטרומטריית מסה, ומתיו מונרו על תצהיר הנתונים. מחקר זה מומן על ידי מענקים ממשרד האנרגיה האמריקאי (DOE) מחקר ביולוגי וסביבתי באמצעות בקרת אפיגנטיקה של תגובת בצורת בסורגום (EPICON) פרויקט תחת מספר הפרס DE-SC0014081, ממשרד החקלאות האמריקאי (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), ובאמצעות מכון BioEnergy המשותף (JBEI), מתקן בחסות DOE (חוזה DE-AC02-05CH11231) בין המעבדה הלאומית לורנס ברקלי DOE. המחקר בוצע באמצעות המעבדה למדעי המולקולריים הסביבתיים (EMSL) (grid.436923.9), משרד DOE של מתקן משתמש מדע בחסות המשרד למחקר ביולוגי וסביבתי.
Materials
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
- Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
- Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor – an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
- Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
- Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
- Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, 121-148 (2017).
- Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
- Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
- Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).
- Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
- Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, 153-168 (2017).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
- Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
- Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
- Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
- Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , (2019).
- Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
- Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
- Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
- Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
- Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).
