عزل هيستون من نسيج أوراق الذرة الرفيعة لقياس الطيف الكتلي العلوي لأسفل من العلامات اللاجينية المحتملة
Summary
وقد تم تطوير البروتوكول لاستخراج فعال histones سليمة من مواد أوراق الذرة الرفيعة لتحديد ملامح التعديلات اللاحقة الهيستون التي يمكن أن تكون بمثابة علامات اللاجينية المحتملة للمساعدة في هندسة المحاصيل المقاومة للجفاف.
Abstract
تنتمي Histones إلى عائلة من البروتينات المحفوظة للغاية في eukaryotes. أنها حزمة الحمض النووي في نيوكلوزومات وحدات وظيفية من الكروماتين. إن التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) من الهستونات، التي تتسم بديناميكية عالية ويمكن إضافتها أو إزالتها بواسطة الإنزيمات، تلعب أدوارًا حاسمة في تنظيم التعبير الجيني. في النباتات، ترتبط العوامل اللاجينية، بما في ذلك PTMs هيستون، باستجاباتها التكيفية للبيئة. يمكن أن يؤدي فهم الآليات الجزيئية للتحكم في اللاجينية إلى توفير فرص غير مسبوقة لحلول الهندسة الحيوية المبتكرة. هنا، نحن وصف بروتوكول لعزل النوى وتنقية histones من أنسجة ورقة الذرة الرفيعة. يمكن تحليل الهستونات المستخرجة في أشكالها سليمة من خلال قياس الطيف الكتلي (MS) من أعلى إلى أسفل إلى جانب الكروماتوغرافيا السائلة (LC) على الإنترنت مع عكس المرحلة (RP). يمكن بسهولة تحديد تركيبات و قياس التشنج من PTMs متعددة على نفس بروتيوفورم الحجر. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الكشف عن قطع ذيل هيستون باستخدام سير العمل LC-MS من أعلى إلى أسفل، وبالتالي، مما يؤدي إلى التشكيل الجانبي PTM العالمي من الهستونات الأساسية (H4، H2A، H2B، H3). لقد طبقنا هذا البروتوكول في السابق على تعريف HISTONE PTMs من أنسجة أوراق الذرة الرفيعة التي تم جمعها من دراسة ميدانية واسعة النطاق ، تهدف إلى تحديد العلامات اللاجينية لمقاومة الجفاف. ويمكن تكييف البروتوكول وتحسينه لتسلسل التسلسل المناعي للكروماتين (ChIP-eq)، أو لدراسة PTMs هيستون في النباتات المماثلة.
Introduction
ومن المتوقع أن تؤثر شدة وتواتر الجفاف المتزايد على إنتاجية محاصيل الحبوب1،2. الذرة الرفيعة هي محصول من الحبوب الغذائية والطاقة معروف بقدرته الاستثنائية على تحمل الظروف التي تحد من المياه3،4. نحن نسعى لفهم ميكانيكي للتفاعل بين الإجهاد الجفاف، والتنمية النباتية، وعلم الوراثة من الذرة الرفيعة[الذرة الرفيعة ثنائية الألوان (L.) Moench). وقد أظهرت أعمالنا السابقة صلات قوية بين النبات وrizosphere الميكروبيوم في التغلب على الجفاف والاستجابات على المستوى الجزيئي5،6،7. وسيمهد هذا البحث الطريق لاستخدام الهندسة اللاجينية في تكييف المحاصيل مع سيناريوهات المناخ في المستقبل. كجزء من الجهود المبذولة لفهم علم الوراثة اللاجينية، نهدف إلى دراسة علامات البروتين التي تؤثر على التعبير الجيني داخل الكائن النباتي.
تنتمي Histones إلى عائلة عالية الحفظ من البروتينات في نوى النياريوتيات التي تحزم الحمض النووي في النويات كوحدات أساسية من الكروماتين. يتم تنظيم التعديلات اللاحقة لترجمات (PTMs) من الهستونات بشكل ديناميكي للتحكم في بنية الكروماتين والتأثير على التعبير الجيني. مثل غيرها من العوامل اللاجينية، بما في ذلك ال DNA methylation، PTMs هيستون تلعب أدوارا هامة في العديد من العمليات البيولوجية8،9. وقد استخدمت على نطاق واسع المقايسات المضادة المستندة إلى مثل البقع الغربية لتحديد وقياس PTMs histone. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون التفاعل بين PTMs histone والحمض النووي بحث فعال من قبل كروماتين المناعي – تسلسل (ChIP-eq)10. في ChIP-seq، يتم إثراء الكروماتين مع محددة المستهدفة هيستون PTM من قبل الأجسام المضادة ضد PTM محددة. ثم، يمكن أن تتحرر شظايا الحمض النووي من الكروماتين المخصب وتسلسل. يتم الكشف عن مناطق الجينات التي تتفاعل مع PTM هيستون المستهدفة. ومع ذلك، تعتمد جميع هذه التجارب بشكل كبير على الأجسام المضادة عالية الجودة. بالنسبة لبعض المتغيرات هيستون / homologs أو مجموعات من PTMs ، يمكن أن يكون تطوير الأجسام المضادة القوية صعبة للغاية (خاصة بالنسبة لـ PTMs متعددة). بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطوير الأجسام المضادة فقط إذا كان من المعروف PTM هيستون المستهدفة. 11 ولذلك، من الضروري إيجاد طرق بديلة لأساليب غير مستهدفة، والتنميط العالمي لـ HISTONE PTMs.
قياس الطيف الكتلي (MS) هو طريقة تكميلية لتوصيف PTMs histone ، بما في ذلك PTMs غير معروف التي الأجسام المضادة غير متوفرة11،12. يستخدم سير عمل MS “من أسفل إلى أعلى” الراسخة البروتيازات لهضم البروتينات إلى ببتيدات صغيرة قبل فصل الكروماتوغرافيا السائلة (LC) والكشف عن التصلب المتعدد. لأن histones لديها أعداد كبيرة من المخلفات الأساسية (ليسين والأرجينين)، والهضم التربسين (البروتياز محددة لايسين والأرجينين) في سير العمل من أسفل إلى أعلى القياسية تخفيضات البروتينات في الببتيدات قصيرة جدا. الببتيدات القصيرة يصعب تحليلها من الناحية الفنية بواسطة LC-MS القياسية، ولا تحافظ على المعلومات حول الاتصال والقياس الرصين لـ PTMs متعددة. استخدام الإنزيمات الأخرى أو وضع العلامات الكيميائية لمنع lysines يولد الببتيدات الأطول التي هي أكثر ملاءمة لتوصيف PTMs هيستون13,14.
بدلا من ذلك، يمكن حذف خطوة الهضم تماما. في هذا النهج “من أعلى إلى أسفل”، يتم إدخال أيونات البروتين سليمة في التصلب العصبي المتعدد عن طريق التأين الكهربائي (ESI) بعد فصل LC على الانترنت، مما أسفر عن أيونات من بروتيوفورم هيستون سليمة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن عزل الأيونات (أي بروتيوفورمات) ذات الأهمية وتفتيتها في مطياف الكتلة لتسفر عن أيونات التسلسل لتحديد الهوية وتوطين PTM. ومن ثم، فإن MS من أعلى إلى أسفل لديه ميزة للحفاظ على المعلومات على مستوى البروتيفورم والتقاط الاتصال متعددة PTMs والقتابات الطرفية على نفس البروتيوفورم15،16. ويمكن أيضا أن توفر التجارب من أعلى إلى أسفل معلومات كمية وتقديم رؤى من المؤشرات الحيوية في مستوى البروتين سليمة17. هنا، ونحن وصف بروتوكول لاستخراج هيستون من ورقة الذرة البيضاء وتحليل histones سليمة من أعلى إلى أسفل LC-MS.
والبيانات التي تظهر في الشكل 1 والشكل 2 هي من أوراق الذرة الرفيعة التي تم جمعها في الأسبوع الثاني بعد الزراعة. على الرغم من توقع اختلاف العائد، فإن هذا البروتوكول غير ملحد لظروف عينة محددة. وقد تم استخدام البروتوكول نفسه بنجاح لالأنسجة نبات الذرة الرفيعة التي تم جمعها من 2، 3، 5، 8، 9، و 10 أسابيع بعد زرع.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول المعروض يصف كيفية استخراج histones من أوراق الذرة (أو عموما ورقة النبات) عينات. ومن المتوقع أن يكون متوسط العائد من الحجر الهحي 2-20 ميكروغرام لكل 4-5 غرام من مادة أوراق الذرة الرفيعة. المواد هي نقية بما فيه الكفاية لتحليل المصب هيستون من قبل LC-MS (في الغالب histones مع ~ 20٪ تلوث البروتين الري?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر رونالد مور وتوماس فيلمور للمساعدة في تجارب الطيف الشامل، وماثيو مونرو لترسب البيانات. تم تمويل هذا البحث من خلال منح من وزارة الطاقة الأمريكية (DOE) البحوث البيولوجية والبيئية من خلال مكافحة اللاجينية لمكافحة الجفاف في مشروع SORGHUM (EPICON) تحت رقم المنحة DE-SC0014081، من وزارة الزراعة الأمريكية (وزارة الزراعة الأمريكية( CRIS 2030-21430-008-00D)، ومن خلال معهد الطاقة الحيوية المشترك (JBEI)، وهو مرفق برعاية DOE (العقد DE-AC02-05CH11231) بين مختبر لورانس بيركلي الوطني و DOE. وقد أُجري البحث باستخدام مختبر العلوم الجزيئية البيئية (EMSL) (grid.436923.9)، وهو مرفق تابع لمكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة برعاية مكتب البحوث البيولوجية والبيئية.
Materials
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
- Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
- Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor – an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
- Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
- Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
- Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, 121-148 (2017).
- Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
- Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
- Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).
- Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
- Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, 153-168 (2017).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
- Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
- Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
- Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
- Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , (2019).
- Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
- Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
- Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
- Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
- Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).
