Isolering af Histone fra Sorghum Leaf Tissue for Top Down Massespektrometri Profilering af potentielle epigenetiske markører
Summary
Protokollen er udviklet til effektivt at udtrække intakte histoner fra sorghum bladmaterialer til profilering af histone post-translationelle modifikationer, der kan tjene som potentielle epigenetiske markører til støtte engineering tørke resistente afgrøder.
Abstract
Histoner tilhører en familie af stærkt bevarede proteiner i eukaryoter. De pakker DNA ind i nukleosomer som funktionelle enheder af chromatin. Postoversættelsesændringer (PTM’er) af histoner, som er meget dynamiske og kan tilsættes eller fjernes af enzymer, spiller afgørende roller i reguleringen af genekspression. I planter er epigenetiske faktorer, herunder histone-PTM’er, relateret til deres adaptive reaktioner på miljøet. Forståelse af de molekylære mekanismer i epigenetisk kontrol kan give hidtil usete muligheder for innovative bioengineeringsløsninger. Heri beskriver vi en protokol til at isolere kernerne og rense histoner fra sorghum bladvæv. De udvundne histoner kan analyseres i deres intakte former ved top-down massespektrometri (MS) kombineret med online omvendt fase (RP) flydende kromatografi (LC). Kombinationer og støkiometri af flere PTMs på samme histone proteoform kan let identificeres. Derudover kan histone hale klipning påvises ved hjælp af top-down LC-MS workflow, således at give den globale PTM profil af centrale histoner (H4, H2A, H2B, H3). Vi har anvendt denne protokol tidligere til at profilere histone PTMs fra sorghum bladvæv indsamlet fra en storstilet feltundersøgelse, der har til formål at identificere epigenetiske markører for tørkeresistens. Protokollen kan potentielt tilpasses og optimeres til chromatin immunoprecipitation-sekventering (ChIP-seq), eller til at studere histone PTMs i lignende planter.
Introduction
Tørkens stigende alvor og hyppighed forventes at påvirke kornafgrødernes produktivitet1,2. Sorghum er en kornfødevare – og energiafgrøde , der er kendt for sin ekstraordinære evne til at modstå vandbegrænsende forhold3,4. Vi forfølger mekanistisk forståelse af samspillet mellem tørke stress, planteudvikling, og epigenetik af sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench] planter. Vores tidligere arbejde har vist stærke forbindelser mellem plante og rhizosfære mikrobiom i tørke akklimatisering og reaktioner på molekylært niveau5,6,7. Denne forskning vil bane vejen for at udnytte epigenetisk teknik til at tilpasse afgrøder til fremtidige klimascenarier. Som en del af indsatsen for at forstå epigenetik sigter vi mod at studere proteinmarkører, der påvirker genekspressionen i planteorganismen.
Histoner tilhører en meget bevaret familie af proteiner i eukaryoter, der pakker DNA i nukleosomer som grundlæggende enheder af kromatin. Postoversættelsesændringer (PTM’er) af histoner reguleres dynamisk for at kontrollere kromatinstrukturen og påvirke genekspression. Ligesom andre epigenetiske faktorer, herunder DNA-methylering, spiller histone PTMs vigtige roller i mange biologiske processer8,9. Antistof-baserede assays såsom vestlige blots har i vid udstrækning været brugt til at identificere og kvantificere histone PTMs. Desuden kan samspillet mellem histone PTMs og DNA effektivt undersøges ved Chromatin immunoprecipitation – sekventering (ChIP-seq)10. I ChIP-seq beriges chromatin med specifik målrettet histone PTM af antistoffer mod den specifikke PTM. Derefter kan DNA-fragmenter frigives fra den berigede kromatin og sekventeres. Regioner af gener, der interagerer med den målrettede histone PTM er afsløret. Men alle disse eksperimenter er stærkt afhængige af antistoffer af høj kvalitet. For nogle histonevarianter/homologer eller kombinationer af PTM’er kan udvikling af robuste antistoffer være ekstremt udfordrende (især for flere PTM’er). Derudover kan antistoffer kun udvikles, hvis den målrettede histone PTM er kendt. 11 Det er derfor nødvendigt med alternative metoder til ikke-målrettet, global profilering af histone-PTM’er.
Massespektrometri (MS) er en supplerende metode til at karakterisere histone-PTM’er, herunder ukendte PTM’er, for hvilke antistoffer ikke er tilgængelige11,12. Den veletablerede “bottom-up” MS-arbejdsgang bruger proteaser til at fordøje proteiner i små peptider før væskekromatografi (LC) adskillelse og MS-detektion. Fordi histoner har et stort antal grundlæggende rester (lysin og arginin), skærer trypsin fordøjelsen (protease specifik for lysin og arginin) i standard bottom-up workflow proteinerne i meget korte peptider. De korte peptider er teknisk vanskelige at analysere af standard LC-MS, og bevarer ikke oplysningerne om tilslutningsmuligheder og støkiometri af flere PTM’er. Brugen af andre enzymer eller kemisk mærkning til at blokere lysiner genererer længere peptider, der er mere egnede til karakterisering af histone PTMs13,14.
Alternativt kan fordøjelsestrinnet udelades fuldstændigt. I denne “top-down” tilgang introduceres intakte proteinioner i MS ved elektrosprayionisering (ESI) efter online LC-adskillelse, hvilket giver ioner af de intakte histone-proteoformer. Desuden kan ioner (dvs. proteoformer) af interesse isoleres og fragmenteres i massespektrometeret for at give sekvensionerne til identifikation og PTM-lokalisering. Derfor top-down MS har den fordel at bevare proteoform-niveau oplysninger og fange tilslutningen af flere PTMs og terminal afkortninger på samme proteoform15,16. Top-down-eksperimenter kan også give kvantitativ information og give indsigt i biomarkører på det intakte proteinniveau17. Heri beskriver vi en protokol til at udtrække histone fra sorghumblad og analysere de intakte histoner ved top-down LC-MS.
De eksempeldata, der er vist i figur 1 og figur 2, er fra sorghumblad indsamlet i uge 2 efter plantningen. Selv om der forventes variation i udbyttet, er denne protokol generelt agnostiker over for specifikke prøvebetingelser. Den samme protokol er med succes blevet brugt til sorghum plantebladvæv indsamlet fra 2, 3, 5, 8, 9 og 10 uger efter plantning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den præsenterede protokol beskriver, hvordan man udtrækker histoner fra sorghumblad (eller mere generelt planteblad) prøver. Det gennemsnitlige histoneudbytte forventes at blive 2-20 μg pr. 4-5 g sorghumbladmateriale. Materialerne er tilstrækkeligt rene til downstream histone analyse af LC-MS (for det meste histoner med ~ 20% ribosomal proteinforurening). Lavere udbytte kan opnås på grund af stikprøvevariationer eller potentiel forkert håndtering/svigt i hele protokollen. Det er af afgørende betydning at bevare…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Ronald Moore og Thomas Fillmore for at hjælpe med massespektrometri eksperimenter, og Matthew Monroe for data deposition. Denne forskning blev finansieret af tilskud fra US Department of Energy (DOE) Biological and Environmental Research gennem Epigenetic Control of Drought Response i Sorghum (EPICON) projekt under tildeling nummer DE-SC0014081, fra US Department of Agriculture (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), og gennem Joint BioEnergy Institute (JBEI), en facilitet sponsoreret af DOE (Contract DE-AC02-05CH11231) mellem Lawrence Berkeley National Laboratory og DOE. Forskningen blev udført ved hjælp af Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) (grid.436923.9), en DOE Office of Science User Facility sponsoreret af Office of Biological and Environmental Research.
Materials
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
- Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
- Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor – an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
- Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
- Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
- Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, 121-148 (2017).
- Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
- Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
- Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).
- Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
- Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, 153-168 (2017).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
- Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
- Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
- Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
- Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , (2019).
- Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
- Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
- Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
- Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
- Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).
