Isolatie van histone van Sorghum Leaf Tissue voor Top Down Mass Spectrometry Profiling van potentiële epigenetische markers
Summary
Het protocol is ontwikkeld om intacte histonen effectief te extraheren uit sorghumbladmaterialen voor profilering van histon post-translationele modificaties die kunnen dienen als potentiële epigenetische markers om droogtebestendige gewassen te helpen.
Abstract
Histonen behoren tot een familie van sterk geconserveerde eiwitten in eukaryoten. Ze verpakken DNA in nucleosomen als functionele eenheden van chromatine. Post-translationele modificaties (PTM’s) van histonen, die zeer dynamisch zijn en door enzymen kunnen worden toegevoegd of verwijderd, spelen een cruciale rol bij het reguleren van genexpressie. In planten zijn epigenetische factoren, waaronder histon-PTM’s, gerelateerd aan hun adaptieve reacties op het milieu. Inzicht in de moleculaire mechanismen van epigenetische controle kan ongekende mogelijkheden bieden voor innovatieve bio-engineeringoplossingen. Hierin beschrijven we een protocol om de kernen te isoleren en histonen te zuiveren uit sorghumbladweefsel. De geëxtraheerde histonen kunnen in hun intacte vormen worden geanalyseerd door top-down massaspectrometrie (MS) in combinatie met online reversed-phase (RP) vloeibare chromatografie (LC). Combinaties en stoichiometrie van meerdere PTM’s op dezelfde histon proteoform kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd. Bovendien kan histone tail clipping worden gedetecteerd met behulp van de top-down LC-MS workflow, wat het wereldwijde PTM-profiel van kerntonen oplevert (H4, H2A, H2B, H3). We hebben dit protocol eerder toegepast om histon-PTM’s te profileren uit sorghumbladweefsel verzameld uit een grootschalig veldonderzoek, gericht op het identificeren van epigenetische markers van droogtebestendigheid. Het protocol kan mogelijk worden aangepast en geoptimaliseerd voor chromatine immunoprecipatie-sequencing (ChIP-seq), of voor het bestuderen van histon PTM’s in vergelijkbare planten.
Introduction
De toenemende ernst en frequentie van de droogte zal naar verwachting van invloed zijn op de productiviteit van graangewassen1,2. Sorghum is een graanvoedsel – en energiegewas dat bekend staat om zijn uitzonderlijke vermogen om waterbeperkende omstandigheden te weerstaan3,4. We streven naar mechanistisch begrip van het samenspel tussen droogtestress, plantenontwikkeling en epigenetica van sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench] planten. Ons vorige werk heeft sterke verbindingen aangetoond tussen het microbioom van planten en rhizosfeer bij droogte acclimatisatie en reacties op moleculair niveau5,6,7. Dit onderzoek zal de weg vrijmaken voor het gebruik van epigenetische engineering bij het aanpassen van gewassen aan toekomstige klimaatscenario’s. Als onderdeel van de inspanningen om epigenetica te begrijpen, streven we ernaar eiwitmarkers te bestuderen die de genexpressie in het plantenorganisme beïnvloeden.
Histonen behoren tot een sterk geconserveerde familie van eiwitten in eukaryoten die DNA in nucleosomen verpakken als fundamentele eenheden van chromatine. Post-translationele modificaties (PTM’s) van histonen zijn dynamisch gereguleerd om de chromatinestructuur te beheersen en de genexpressie te beïnvloeden. Net als andere epigenetische factoren, waaronder DNA-methylatie, spelen histon-PTM’s een belangrijke rol in veel biologische processen8,9. Op antilichamen gebaseerde tests zoals westerse vlekken zijn veel gebruikt om histon-PTM’s te identificeren en te kwantificeren. Bovendien kan de interactie van histon-PTM’s en DNA effectief worden onderzocht door Chromatine-immunoprecipitatie – sequencing (ChIP-seq)10. In ChIP-seq wordt chromatine met specifieke gerichte histon PTM verrijkt met antilichamen tegen die specifieke PTM. Vervolgens kunnen de DNA-fragmenten uit het verrijkte chromatine worden vrijgegeven en worden gesequentieerd. Regio’s van genen die interageren met de beoogde histon PTM worden onthuld. Al deze experimenten zijn echter sterk afhankelijk van antilichamen van hoge kwaliteit. Voor sommige histonvarianten/homologen of combinaties van PTM’s kan de ontwikkeling van robuuste antilichamen zeer uitdagend zijn (vooral voor meerdere PTM’s). Bovendien kunnen antilichamen alleen worden ontwikkeld als de beoogde histon PTM bekend is. 11 Daarom zijn alternatieve methoden nodig voor ongetargette, globale profilering van histon-PTM’s.
Massaspectrometrie (MS) is een aanvullende methode om histon-PTM ‘s te karakteriseren, met inbegrip van onbekende PTM ‘s waarvoor geen antilichamen beschikbaar zijn11,12. De gevestigde “bottom-up” MS-workflow maakt gebruik van proteasen om eiwitten te verteren tot kleine peptiden voorafgaand aan vloeistofchromatografie (LC) scheiding en MS-detectie. Omdat histonen grote aantallen basisresten (lysine en arginine) hebben, snijdt de trypsinevertering (protease specifiek voor lysine en arginine) in de standaard bottom-up workflow de eiwitten in zeer korte peptiden. De korte peptiden zijn technisch moeilijk te analyseren door standaard LC-MS, en behouden niet de informatie over de connectiviteit en stoichiometrie van meerdere PTMs. Het gebruik van andere enzymen of chemische etikettering om lysines te blokkeren genereert langere peptiden die meer geschikt zijn voor karakterisering van histone PTMs13,14.
Als alternatief kan de spijsverteringsstap volledig worden weggelaten. In deze “top-down” benadering worden intacte eiwitionen in de MS geïntroduceerd door elektrospray ionisatie (ESI) na online LC-scheiding, wat ionen oplevert van de intacte histon proteoformen. Bovendien kunnen ionen (d.w.z. proteoformen) van belang worden geïsoleerd en gefragmenteerd in de massaspectrometer om de sequentie-ionen voor identificatie en PTM-lokalisatie op te leveren. Daarom heeft top-down MS het voordeel dat de informatie op proteoform-niveau behouden blijft en de connectiviteit van meerdere PTM ‘s en terminale afknijpingen op hetzelfde proteoform15,16vastlegt . Top-down experimenten kunnen ook kwantitatieve informatie bieden en inzichten bieden van biomarkers op het intacte eiwitniveau17. Hierin beschrijven we een protocol om histon uit sorghumblad te extraheren en de intacte histonen te analyseren door LC-MS van bovenaf.
De voorbeeldgegevens in figuur 1 en figuur 2 zijn afkomstig van sorghumblad dat in week 2 na het planten is verzameld. Hoewel variatie van de opbrengst wordt verwacht, is dit protocol over het algemeen agnostisch voor specifieke steekproefomstandigheden. Hetzelfde protocol is met succes gebruikt voor sorghum plantenbladweefsel verzameld vanaf 2, 3, 5, 8, 9 en 10 weken na het planten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gepresenteerde protocol beschrijft hoe histonen uit sorghumbladmonsters (of meer in het algemeen plantenblad) kunnen worden geëxtraheerd. De gemiddelde histonopbrengst zal naar verwachting 2-20 μg per 4-5 g sorghumbladmateriaal zijn. De materialen zijn voldoende zuiver voor de downstream histonanalyse door LC-MS (meestal histonen met ~20% ribosomale eiwitbesmetting). Een lager rendement kan worden verkregen als gevolg van monstervariaties of mogelijke verkeerde behandeling/fouten in het hele protocol. Het handhaven…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Ronald Moore en Thomas Fillmore voor het helpen met massaspectrometrie-experimenten, en Matthew Monroe voor gegevensdepositie. Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidies van het Us Department of Energy (DOE) Biological and Environmental Research via het Epigenetic Control of Drought Response in Sorghum (EPICON) project onder awardnummer DE-SC0014081, van het Amerikaanse Ministerie van Landbouw (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), en via het Joint BioEnergy Institute (JBEI), een faciliteit gesponsord door DOE (Contract DE-AC02-05CH11231) tussen Lawrence Berkeley National Laboratory en DOE. Het onderzoek werd uitgevoerd met behulp van Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) (grid.436923.9), een DOE Office of Science User Facility gesponsord door het Office of Biological and Environmental Research.
Materials
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
- Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
- Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor – an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
- Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
- Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
- Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, 121-148 (2017).
- Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
- Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
- Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).
- Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
- Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, 153-168 (2017).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
- Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
- Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
- Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
- Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , (2019).
- Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
- Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
- Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
- Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
- Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).
