이 프로토콜은 엔지니어링 가뭄 내성 작물을 돕기 위해 잠재적 후성 유전학 마커역할을 할 수 있는 번역 후 변형 후 프로파일링을 위해 사탕수잎 재료로부터 손상되지 않은 히스톤을 효과적으로 추출하기 위해 개발되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
히스톤은 진핵생물에 있는 고도로 보존된 단백질의 가족에 속합니다. 그(것)들은 크로마틴의 기능적인 단위로 뉴클레오소좀으로 DNA를 포장합니다. 매우 역동적이고 효소에 의해 추가되거나 제거될 수 있는 히스톤의 번역 후 변형(PTM)은 유전자 발현 조절에 중요한 역할을 합니다. 식물에서, 후성 유전학 요인, histone PTM을 포함 하 여, 환경에 그들의 적응 응답과 관련. 후성 유전학 적 제어의 분자 메커니즘을 이해하면 혁신적인 생명 공학 솔루션에 전례없는 기회를 가져올 수 있습니다. 본명, 우리는 핵을 분리하고 사탕수수 잎 조직에서 히스톤을 정화하는 프로토콜을 설명합니다. 추출된 히스톤은 온라인 반전 단계(RP) 액체 크로마토그래피(LC)와 결합된 하향식 질량 분석법(MS)에 의해 온전한 형태로 분석될 수 있다. 동일한 히스톤 프로테오폼에 여러 PTM의 조합 과 스토이치오메트리를 쉽게 식별할 수 있다. 또한, 히스톤 테일 클리핑은 하향식 LC-MS 워크플로우를 이용하여 검출될 수 있으므로 코어 히스톤(H4, H2A, H2B, H3)의 글로벌 PTM 프로파일을 산출할 수 있다. 우리는 가뭄 저항의 후성 유전학 마커를 확인하기 위한 대규모 필드 연구 결과에서 집합된 사탕잎 조직에서 히스톤 PTM을 프로파일링하기 위하여 이전에 이 프로토콜을 적용했습니다. 이 프로토콜은 잠재적으로 크롬마틴 면역 침전 시퀀싱(ChIP-seq)에 맞게 조정되고 최적화될 수 있으며, 유사한 식물에서 그의 음색 PTM을 연구할 수 있습니다.
서론
가뭄의 심각도와 빈도가 증가하면 시리얼 작물1,2의생산성에 영향을 미칠 것으로 예상됩니다. 수쿰은3,4의수중제한조건을 견딜 수 있는 뛰어난 능력으로 유명한 시리얼 식품 및 에너지 작물입니다. 우리는 가뭄 스트레스, 식물 개발 및 사탕수수의 후성 유전학 사이의 상호 작용에 대한 기계적 이해를 추구하고 있습니다 [수줌 바이 컬러 (L.) Moench] 식물. 우리의 이전 작품은 가뭄 적응과 분자수준5,6,7에서반응에 식물과 뿌리 부피 미생물군유전체 사이의 강한 연결을 입증했다. 이 연구는 미래의 기후 시나리오에 작물을 적응에 후성 유전학 공학을 활용하기위한 길을 열 것입니다. 후성유전학을 이해하는 노력의 일환으로, 우리는 식물 유기체 내의 유전자 발현에 영향을 미치는 단백질 마커를 연구하는 것을 목표로 합니다.
히스톤은 크로마틴의 기본 단위로 뉴클레오소로 D....
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프로토콜
1. 사탕수수 잎 소재 준비
참고 : 사탕수수 식물은 칼리어, 캘리포니아에있는 필드에 토양에서 재배되었다.
- 식물에서 수중 잎을 50mL 원심분리기 튜브로 수집하고 즉시 액체 질소로 튜브를 얼릴 수 있습니다. 제 3 및 네 번째 완전히 출현 한 잎을 1 차 경작기에서 떼어 내며 잎 조직을 수집하십시오.
참고: 현장 상태, 샘플 증가 및 수집에 대한 자세한 내용은 게시된 보고서18에서찾을 수 있습니다. - 액체 질소로 잎을 갈아서 원심분리기 튜브로 즉시 옮깁니다.
- 사용할 때까지 -80 °C에 접지 잎을 저장합니다. 각 샘플의 히스톤 분석을 위해 저온 분쇄 잎 분말 약 4 g을 섭취하십시오.
2. 버퍼 및 재료 준비 (3-4 시간)
참고: 고농도 재고 솔루션은 미리 만들어 사용할 때까지 저장할 수 있습니다. 그러나 모든 작업 버퍼는 추출 당일 (재고 희석 및 다른 내용과 혼합하여) 신선하게 만들어져야하며 공정 중에 얼음위에 두어야합니다. 그렇지 않으면 권장하지 않는 한 전체 실험은 4 °C에서 수행되어야합니다.
- 연속 교반이 ....
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결과
프로토콜에 따라, 히스톤은 LC-MS 분석을 사용하여 추출 및 식별될 수 있다. 원시 데이터 및 처리된 결과는 액세스를 통해 MassIVE(https://massive.ucsd.edu/)에서 사용할 수 있습니다: MSV0000085770. 대표 샘플(MassIVE에서도 사용 가능)의 TopPIC 결과를 바탕으로 303개의 히스톤 프로테오폼(106 H2A, 72 H2B, 103 H3 및 22 H4 프로테오폼)을 확인했습니다. 공동 정제 리보소말 프로테오폼도 검출되었으며, 일반적으로 LC초기에 발례한다. 그들은 일반적으로 식별 된 프로테오폼의 ~20 %로 구성되지만 LC 그라데이션의 후반 단계에서 용출하는 히스톤 프로테오폼과 겹치지 않습니다. 결과는 최신 TopPIC 또는 정보 프로테오믹스 패키지로 쉽게 시각화할 수 있습니다. 데모를 위해 원시 MS 파일을 직접 로드하고 프로테오폼 식별을 수동으로 검사하는 데 사용할 수 있는 정보-Proteomics 패키지를 사용하여 데이터 시각화에 중점을 둡니다. 두 소프트웨어 패키지 모두 서로 .......
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토론
제시된 프로토콜은 사탕수수 잎(또는 일반적으로 식물 잎) 샘플에서 히스톤을 추출하는 방법을 설명합니다. 평균 히스톤 수율은 4-5g 의 사탕수수 잎 재료당 2-20 μg가 될 것으로 예상됩니다. 재료는 LC-MS에 의한 하류 히스톤 분석에 대해 충분히 순수합니다 (대부분 - 20 % 리보솜 단백질 오염이있는 히스톤). 샘플 변형 또는 프로토콜 전체의 잠재적 인 오류 처리 / 오류로 인해 낮은 수율을 얻을 수 있습니다. 핵 리시스 단계 전에 핵의 무결성을 유지하는 것은 중요합니다. 따라서 NLB를 추가하기 전에 공격적인 소용돌이 및 파이펫팅을 피해야 합니다. 또한, 펠릿으로부터 초중자를 제거할 때 핵의 손실이 발생할 수 있다. 파이프를 할 때 펠릿을 방해하지 않도록주의해야합니다. 트리톤 X-100 농도는 1%로 비표적 소기관을 선택적으로 리세이크하도록 최적화되었지만 핵(step 3.2)은 아니다. 다른 조직 또는 유기체에 대한 최적의 세제 농도는 다를 수 있으며 실험적으로 결정될 필요가 있습니다. 여과 과정에서 상체의 색상 변경은.......
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감사의 글
우리는 대량 분광 실험에 도움을 준 로널드 무어와 토마스 필모어, 그리고 매튜 먼로에게 데이터 증착을 해준 것에 감사드립니다. 이 연구는 미국 농무부(USDA)의 수상 번호 DE-SC0014081에 따라 수쿰(EPICON) 프로젝트에서 가뭄 대응의 후성유전학 적 통제를 통해 미국 에너지부 (DOE) 생물 및 환경 연구의 보조금에 의해 지원되었다; CRIS 2030-21430-008-00D, 그리고 공동 바이오 에너지 연구소 (JBEI)를 통해, 로렌스 버클리 국립 연구소와 DOE 사이의 DOE (계약 DE-AC02-05CH11231)가 후원하는 시설. 이 연구는 생물환경연구실이 후원하는 과학사용자 시설 DOE 사무소인 환경 분자 과학 연구소(EMSL)(grid.436923.9)를 사용하여 수행되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아세토니트릴 | 피셔 케미컬 | A955-4L | |
| 디티오트레이톨(DTT) | 시그마 | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM 용액, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| 포름산 | Thermo Scientific | 28905 | |
| 구아니딘 하이드로클로라이드 | 시그마 | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| 인산칼륨, 이염기성 | Sigma | P3786-100G | |
| 프로테아제 억제제 칵테일, cOmplete 정제 | Roche | 5892791001 | |
| 부티르산나트륨 | Sigma | 303410-5G | 히스톤 탈아세틸화효소 억제제에 사용 |
| 염화나트륨(NaCl) | Sigma | S1888 | |
| 나트륨 불소 | 시그마 | S7020-100G | 인산가수분해효소 억제제에 사용 |
| 오르토바나데이트 | 시그마 | 450243-10G | 인산가수분해효소 억제제에 사용 |
| 설탕 | 시그마 | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| 트리톤 X-100 | 시그마 | T9284-100ML | |
| 약한 양이온 교환 수지, 메쉬 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | 이것은 식물 핵 추출을 위한 Sigma 키트(카탈로그 # CELLYTPN1)의 일부입니다. 메쉬 크기가 같은 유사한 필터를 사용할 수 있습니다. |
| 마이크로피펫 팁(P20, P200, P1000) | 시그마 | ||
| 튜브, 50mL/15mL, 원심분리기, 원뿔 | Genesee Scientific | 28-103 | |
| 튜브, 마이크로 원심분리기, 1.5/2 | mL Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| 비커( 50mL – 2L) | |||
| 냉각 기능이 있는 마이크로 원심분리기 | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| 마이크로피펫 | |||
| 냉각 기능이 있는 스윙 버킷 원심분리기 | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| 수조 초음파 발생기 | Fisher Scientific | 15-336-120 |
참고문헌
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Clim....
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재인쇄 및 허가
