संभावित एपिजेनेटिक मार्कर के टॉप डाउन मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोफाइलिंग के लिए ज्वार लीफ टिश्यू से हिस्टोन का अलगाव
Summary
प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से हिस्टोन के बाद अनुवाद संशोधनों की प्रोफाइलिंग के लिए ज्वार पत्ती सामग्री से बरकरार हिस्टटोन निकालने के लिए विकसित किया गया है जो इंजीनियरिंग सूखा प्रतिरोधी फसलों की सहायता के लिए संभावित एपीजेनेटिक मार्कर के रूप में काम कर सकते हैं ।
Abstract
हिटोन यूकेरियोट्स में अत्यधिक संरक्षित प्रोटीन के परिवार से संबंधित हैं। वे डीएनए को क्रोमेटिन की कार्यात्मक इकाइयों के रूप में न्यूकोसोम में पैक करते हैं। हिस्टन के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) जो अत्यधिक गतिशील होते हैं और एंजाइमों द्वारा जोड़े या हटाए जा सकते हैं, जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। पौधों में, हिस्टोन पीटीएम सहित एपिजेनेटिक कारक पर्यावरण के प्रति उनकी अनुकूली प्रतिक्रियाओं से संबंधित हैं। एपिजेनेटिक नियंत्रण के आणविक तंत्र को समझना अभिनव बायोइंजीनियरिंग समाधानों के लिए अभूतपूर्व अवसर ला सकता है। इसके साथ ही, हम नाभिक को अलग करने और ज्वार के पत्ते के ऊतकों से हिस्टन को शुद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। निकाले गए हिस्टन का विश्लेषण ऑनलाइन रिवर्स-फेज (आरपी) लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (एलसी) के साथ मिलकर टॉप-डाउन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) द्वारा उनके अक्षुण्ण रूपों में किया जा सकता है । एक ही हिस्टोन प्रोटेफॉर्म पर कई पीटीएमएस के संयोजन और स्टोइचिओमेट्री को आसानी से पहचाना जा सकता है। इसके अलावा, हाईस्टोन टेल क्लिपिंग का पता टॉप-डाउन एलसी-एमएस वर्कफ्लो का उपयोग करके लगाया जा सकता है, इस प्रकार, कोर हिस्टोन (एच 4, एच2ए, एच 2 बी, एच 3) के वैश्विक पीटीएम प्रोफाइल का परिणाम है। हमने इस प्रोटोकॉल को पहले बड़े पैमाने पर क्षेत्र अध्ययन से एकत्र ज्वार के पत्ते के ऊतकों से प्रोफाइल हिस्टोन पीटीएम के लिए लागू किया है, जिसका उद्देश्य सूखे प्रतिरोध के एपीजेनेटिक मार्कर की पहचान करना है। प्रोटोकॉल को संभावित रूप से क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिपिटेशन-अनुक्रमण (ChIP-seq) के लिए अनुकूलित और अनुकूलित किया जा सकता है, या इसी तरह के पौधों में हिस्टोन पीटीएम का अध्ययन करने के लिए।
Introduction
सूखे की बढ़ती गंभीरता और बारंबारता से अनाज फसलों की उत्पादकता प्रभावित होने की संभावना है1,2. ज्वार एक अनाज खाद्य और ऊर्जा फसल है जो पानी को सीमित करने की असाधारण क्षमता के लिए जानी जाती है3,4। हम सूखे के तनाव, पौधों के विकास और ज्वार के एपिजेनेटिक्स[ज्वार द्विरंगी (एल) मोंच] पौधों के बीच परस्पर क्रिया की यंत्रवादी समझ का पीछा कर रहे हैं । हमारे पिछले कार्य ने सूखे की वृद्धि और आणविक स्तर 5,6,7पर प्रतिक्रियाओं में पौधे और राइजोसिफेयर माइक्रोबायोम के बीच मजबूत संबंधों का प्रदर्शन किया है । यह शोध भविष्य के जलवायु परिदृश्यों के लिए फसलों को अनुकूल बनाने में एपिजेनेटिक इंजीनियरिंग का उपयोग करने का मार्ग प्रशस्त करेगा । एपिजेनेटिक्स को समझने के प्रयासों के एक भाग के रूप में, हमारा उद्देश्य प्रोटीन मार्कर का अध्ययन करना है जो पौधे के जीव के भीतर जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करते हैं ।
हिस्टोन यूकेरियोट्स में प्रोटीन के एक अत्यधिक संरक्षित परिवार से संबंधित हैं जो डीएनए को गुणसूत्रों की मौलिक इकाइयों के रूप में न्यूकोसोम में पैक करते हैं। हिटोन के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) को क्रोमेटिन संरचना को नियंत्रित करने और जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करने के लिए गतिशील रूप से विनियमित किया जाता है। डीएनए मिथाइलेशन सहित अन्य एपिजेनेटिक कारकों की तरह, हिस्टोन पीटीएम कई जैविक प्रक्रियाओं8, 9में महत्वपूर्ण भूमिकानिभातेहैं। एंटीबॉडी आधारित परख जैसे पश्चिमी धब्बे व्यापक रूप से पहचान और हिस्टोन PTMs की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इसके अलावा, हिस्टोन पीटीएम और डीएनए की बातचीत को क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिCIPITेशन – अनुक्रमण (ChIP-seq)10द्वारा प्रभावी ढंग से जांच की जा सकती है। ChIP-seq में, विशिष्ट लक्षित हिस्टोन पीटीएम के साथ क्रोमेटिन उस विशिष्ट पीटीएम के खिलाफ एंटीबॉडी द्वारा समृद्ध है। फिर, डीएनए के टुकड़े समृद्ध क्रोमेटिन से जारी किए जा सकते हैं और अनुक्रमित हो सकते हैं। जीन के क्षेत्रों है कि लक्षित हिस्टोन पीटीएम के साथ बातचीत से पता चला रहे हैं । हालांकि, ये सभी प्रयोग उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी पर भारी भरोसा करते हैं। कुछ हिस्टोन वेरिएंट/समरूपता या पीटीएमएस के संयोजन के लिए, मजबूत एंटीबॉडी का विकास बेहद चुनौतीपूर्ण हो सकता है (विशेष रूप से कई पीटीएमएस के लिए)। इसके अलावा, एंटीबॉडी केवल तभी विकसित किया जा सकता है जब लक्षित हिस्टोन पीटीएम ज्ञात हो। 11 इसलिए, हिस्टोन पीटीएम की अलक्षित, वैश्विक प्रोफाइलिंग के लिए वैकल्पिक तरीके आवश्यक हैं।
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) हिस्टोन पीटीएम की विशेषता के लिए एक पूरक विधि है, जिसमें अज्ञात पीटीएम शामिल हैं, जिसके लिए एंटीबॉडी11,12उपलब्ध नहीं हैं। अच्छी तरह से स्थापित “बॉटम-अप” एमएस वर्कफ्लो तरल क्रोमेटोग्राफी (एलसी) पृथक्करण और एमएस डिटेक्शन से पहले छोटे पेप्टाइड्स में प्रोटीन को पचाने के लिए प्रोटीज का उपयोग करता है। क्योंकि हिस्टन में बड़ी संख्या में बुनियादी अवशेष (lysine और arginine) होते हैं, ट्राइप्सिन पाचन (lysine और आर्जिनिन के लिए विशिष्ट प्रोटीज) मानक बॉटम-अप वर्कफ्लो में प्रोटीन को बहुत कम पेप्टाइड्स में काटता है। छोटे पेप्टाइड्स तकनीकी रूप से मानक एलसी-एमएस द्वारा विश्लेषण करने के लिए मुश्किल हैं, और कनेक्टिविटी और कई PTMs के stoichiometry के बारे में जानकारी की रक्षा नहीं करते हैं । lysines को ब्लॉक करने के लिए अन्य एंजाइमों या रासायनिक लेबलिंग का उपयोग लंबे समय तक पेप्टाइड्स उत्पन्न करता है जो हिस्टोन पीटीएम13,14के लक्षण वर्णन के लिए अधिक उपयुक्त हैं ।
वैकल्पिक रूप से, पाचन कदम को पूरी तरह से छोड़ा जा सकता है। इस “टॉप-डाउन” दृष्टिकोण में, ऑनलाइन एलसी अलगाव के बाद इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) द्वारा एमएस में अक्षुण्ण प्रोटीन आयनों को पेश किया जाता है, जो बरकरार हिस्टोन प्रोटियोफॉर्म के आयनों को उत्पीडिंग करता है। इसके अलावा, पहचान और पीटीएम स्थानीयकरण के लिए अनुक्रम आयनों को उपज देने के लिए ब्याज के आयनों (यानी, प्रोटियोफॉर्म) को बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर में अलग और खंडित किया जा सकता है। इसलिए, टॉप-डाउन एमएस को प्रोटेफॉर्म-लेवल की जानकारी को संरक्षित करने और एक ही प्रोटेफॉर्म15,16पर कई पीटीएम और टर्मिनल ट्रंकेशन की कनेक्टिविटी पर कब्जा करने का लाभ है। टॉप-डाउन प्रयोग मात्रात्मक जानकारी भी प्रदान कर सकते हैं और बरकरार प्रोटीन स्तर17पर बायोमार्कर की अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। इसके साथ ही, हम ज्वार के पत्ते से हिस्टोन निकालने और ऊपर-नीचे एलसी-एमएस द्वारा बरकरार हिस्टोन का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
चित्रा 1 और चित्रा 2 में दिखाए गए उदाहरण डेटा रोपण के बाद 2 सप्ताह में एकत्र ज्वार के पत्ते से हैं। हालांकि उपज की भिन्नता की उम्मीद है, यह प्रोटोकॉल आम तौर पर विशिष्ट नमूना स्थितियों के लिए नास्तिक है। इसी प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग 2, 3, 5, 8, 9 और रोपण के 10 सप्ताह बाद एकत्र ज्वार के पौधे पत्ती ऊतक के लिए किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तुत प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे ज्वार के पत्ते (या अधिक आम तौर पर संयंत्र पत्ती) नमूनों से हिटोन निकालने के लिए । औसत हिस्टोन उपज 2-20 माइक्रोन प्रति 4-5 ग्राम ज्वार पत्ती सामग्री होने की उम्मीद है। एलसी-ए?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगों के साथ मदद करने के लिए रोनाल्ड मूर और थॉमस फिलमोर को धन्यवाद देते हैं, और डेटा जमाव के लिए मैथ्यू मुनरो। इस शोध को अमेरिकी कृषि विभाग (यूएसडीए) से पुरस्कार संख्या DE-SC0014081 के तहत ज्वार (EPICON) परियोजना में सूखे की प्रतिक्रिया के एपिजेनेटिक नियंत्रण के माध्यम से अमेरिकी ऊर्जा विभाग (डीओई) जैविक और पर्यावरण अनुसंधान से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था; CRIS 2030-21430-008-00D), और संयुक्त जैव ऊर्जा संस्थान (जेबीई) के माध्यम से, एक सुविधा डो (अनुबंध DE-AC02-05CH11231) लॉरेंस बर्कले राष्ट्रीय प्रयोगशाला और डो के बीच द्वारा प्रायोजित । अनुसंधान पर्यावरण आणविक विज्ञान प्रयोगशाला (EMSL) (grid.436923.9), विज्ञान उपयोगकर्ता जैविक और पर्यावरण अनुसंधान के कार्यालय द्वारा प्रायोजित सुविधा के एक डीओई कार्यालय का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था ।
Materials
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
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