潜在的エピジェネティックマーカーのトップダウン質量分析プロファイリングのためのソルガム葉組織からのヒストンの分離
Summary
このプロトコルは、エンジニアリングの干ばつ耐性作物を支援するための潜在的なエピジェネティックマーカーとして機能するヒストン翻訳後修飾のプロファイリングのために、ソルガム葉材料から無傷のヒストンを効果的に抽出するために開発されました。
Abstract
ヒストンは真核生物中の高度に保存されたタンパク質のファミリーに属しています。彼らはクロマチンの機能的単位としてDNAをヌクレオソームに詰め込む。ヒストンのトランスレーショナル後修飾(PTM)は、非常に動的で、酵素によって追加または除去され、遺伝子発現を調節する上で重要な役割を果たします。植物では、ヒストンPTMを含むエピジェネティック要因は、環境に対する適応応答に関連しています。エピジェネティックコントロールの分子メカニズムを理解することは、革新的なバイオエンジニアリングソリューションの前例のない機会をもたらすことができます。ここで、我々は、核を分離し、ソルガム葉組織からヒストンを浄化するプロトコルを記述する。抽出されたヒストンは、トップダウン質量分析(MS)とオンライン逆相(RP)液体クロマトグラフィー(LC)を組み合わせることで、無傷の形態で分析することができます。同じヒストンプロテオーフォーム上の複数のPTMの組み合わせおよび量合体測定は容易に同定することができる。さらに、ヒストンテールクリッピングは、トップダウンLC-MSワークフローを使用して検出することができ、したがって、コアヒストン(H4、H2A、H2B、H3)のグローバルPTMプロファイルを生成します。我々は、以前にこのプロトコルを適用して、干ばつ抵抗性のエピジェネティックマーカーを同定することを目的とした大規模なフィールドスタディから採取したソルガム葉組織からのヒストンPTMをプロファイリングした。このプロトコルは、クロマチン免疫沈降シーケンシング(ChIP-seq)、または同様の植物でヒストンPTMを研究するために適応され、最適化される可能性があります。
Introduction
干ばつの深刻度と頻度の増加は、穀物作物1、2の生産性に影響を与えると予想される。ソルガムは、水を制限する条件3、4に耐えるその例外的な能力のために知られている穀物の食糧とエネルギー作物です。我々は、干ばつストレス、植物の発達、およびソルガム[ソルガム二色(L.)Moench]植物のエピジェネティクス間の相互作用の機械学的理解を追求している。我々の前の研究は、植物と根球微生物叢との間の強い関係を、干ばつ順応と分子レベル5、6、7での応答で実証した。この研究は、将来の気候シナリオに作物を適応させる上でエピジェネティック工学を利用する道を開く。エピジェネティクスの理解の一環として、植物生物の遺伝子発現に影響を与えるタンパク質マーカーの研究を目指しています。
ヒストンは、真核生物中のタンパク質の高度に保存されたファミリーに属し、DNAをクロマチンの基本単位としてヌクレオソームに詰め込みます。ヒストンの翻訳後修飾(PTM)は、クロマチン構造を制御し、遺伝子発現に影響を与えるために動的に調節される。DNAメチル化を含む他のエピジェネティック因子と同様に、ヒストンPTMは多くの生物学的プロセス8,9において重要な役割を果たす。ウエスタンブロットなどの抗体ベースのアッセイは、ヒストンPTMを同定し定量するために広く使用されてきました。さらに、ヒストンPTMsとDNAの相互作用は、クロマチン免疫沈降法(ChIP-seq)10によって効果的にプローブすることができる。ChIP-seqでは、特定の標的ヒストンPTMを有するクロマチンは、その特定のPTMに対する抗体によって濃縮される。次いで、DNA断片を濃縮クロマチンから放出し、配列することができる。標的ヒストンPTMと相互作用する遺伝子の領域が明らかになる。しかし、これらの実験はすべて、高品質の抗体に大きく依存しています。いくつかのヒストン変異体/ホモログまたはPTMの組み合わせでは、堅牢な抗体の開発は非常に困難な場合があります(特に複数のPTMの場合)。さらに、抗体は、標的ヒストンPTMが既知である場合にのみ開発することができる。11したがって、ヒストンPTMの対象を絞り込みずグローバルプロファイリングを行うための代替方法が必要です。
質量分析(MS)は、ヒストンPTMを特徴付ける相補的な方法であり、抗体が利用できない未知のPTMを含む11,12。よく確立された「ボトムアップ」MSワークフローは、液体クロマトグラフィー(LC)分離およびMS検出前にタンパク質を小さなペプチドに消化するためにプロテアーゼを使用します。ヒストンは、塩基性残基(リジンとアルギニン)が多いため、標準的なボトムアップワークフローにおけるトリプシン消化(リジンおよびアルギニンに特異的なプロテアーゼ)は、タンパク質を非常に短いペプチドに切り込みます。短いペプチドは、標準的なLC-MSによる分析が技術的に困難であり、複数のPTMの接続性および量論に関する情報を保持しません。他の酵素または化学標識を使用してリジンをブロックすると、ヒストンPTMs13,14の特性評価に適した長いペプチドが生成される。
あるいは、消化ステップを完全に省略することができる。この「トップダウン」アプローチでは、インタクトプロテインイオンは、オンラインLC分離後にエレクトロスプレーイオン化(ESI)によりMSに導入され、インタクトヒストンプロテオフォームのイオンを生み出します。さらに、目的のイオン(すなわち、プロテオフォーム)を、質量分析計で単離および断片化して、同定およびPTM局在化のために配列イオンを得ることができる。したがって、トップダウンMSは、プロテオフォームレベルの情報を保持し、同じプロテオフォーム15、16上の複数のPTMおよび端末切り捨ての接続性を捕捉する利点を有する。トップダウン実験は、定量的な情報を提供し、インタクトプロテインレベル17でバイオマーカーの洞察を提供することもできます。本明細書では、ソルガム葉からヒストンを抽出し、トップダウンLC-MSによって無傷のヒストンを分析するプロトコルについて述べている。
図1と図2に示すサンプルデータは、植え付け後の第2週に収集されたソルガム葉から取得したものです。収量の変動が予想されるが、このプロトコルは一般に特定のサンプル条件に対して無依存である。同じプロトコルは、植え付け後2、3、5、8、9、および10週間から採取されたソルガム植物葉組織に対して正常に使用されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示されたプロトコルは、ソルガムの葉(またはより一般的には植物葉)サンプルからヒストンを抽出する方法を説明します。ヒストンの平均収量は、4~5gのソルガム葉材料あたり2〜20μgと予想されます。材料はLC-MSによる下流ヒストン分析のために十分に純粋である(ほとんどが約20%リボソームタンパク質汚染を有するヒストン)。低い収率は、サンプルの変動、またはプロトコル全体での誤った…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
大量分析実験を支援してくれたロナルド・ムーアとトーマス・フィルモア、データ沈着に対するマシュー・モンローに感謝します。この研究は、米国農務省(USDA;)から、ソルガム(EPICON)プロジェクトにおける干ばつ反応のエピジェネティックな制御を通じた米国エネルギー省(DOE)生物環境研究からの助成金によって資金提供されました。CRIS 2030-21430-008-00D)、およびローレンス・バークレー国立研究所とDOEの間でDOE(契約DE-AC02-05CH11231)が主催する共同バイオエネルギー研究所(JBEI)を通じて。研究は、生物環境研究室が主催するDOE科学利用者施設事務所である環境分子科学研究所(EMSL)(grid.436923.9)を使用して行われました。
Materials
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
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