Isolering av histon från Sorghum Leaf Tissue för top down masspektrometriprofilering av potentiella epigenetiska markörer
Summary
Protokollet har utvecklats för att effektivt extrahera intakta histoner från sorghumbladmaterial för profilering av hisstone post-translationella modifieringar som kan fungera som potentiella epigenetiska markörer för att underlätta tekniska torka resistenta grödor.
Abstract
Histoner tillhör en familj av mycket bevarade proteiner i eukaryoter. De packar DNA i nukleosomer som funktionella enheter av kromatin. Post-translationella modifieringar (PTMs) av histoner, som är mycket dynamiska och kan läggas till eller tas bort av enzymer, spelar kritiska roller för att reglera genuttryck. I växter är epigenetiska faktorer, inklusive histon PTMs, relaterade till deras adaptiva svar på miljön. Att förstå epigenetisk kontrolls molekylära mekanismer kan ge oöverträffade möjligheter till innovativa bioengineeringslösningar. Häri beskriver vi ett protokoll för att isolera atomkärnorna och rena histoner från sorghum bladvävnad. De extraherade histonerna kan analyseras i sina intakta former genom top-down masspektrometri (MS) i kombination med online omvänd fas (RP) flytande kromatografi (LC). Kombinationer och stoichiometry av flera PTMs på samma histon proteoform kan lätt identifieras. Dessutom kan hisstone tail clipping detekteras med hjälp av LC-MS-arbetsflödet uppifrån och ned, vilket ger den globala PTM-profilen för kärn histoner (H4, H2A, H2B, H3). Vi har tillämpat detta protokoll tidigare för att profilera histon PTMs från sorghum bladvävnad samlas in från en storskalig fältstudie, syftar till att identifiera epigenetiska markörer för torka resistens. Protokollet kan potentiellt anpassas och optimeras för kromatin immunoprecipitation-sekvensering (ChIP-seq), eller för att studera histon PTMs i liknande växter.
Introduction
Den ökande svårighetsgraden och frekvensen av torka förväntas påverka produktiviteten hos spannmålsgrödor1,2. Sorghum är en spannmålsmat och energigröda känd för sin exceptionella förmåga att motstå vattenbegränsande förhållanden3,4. Vi eftersträvar mekanistisk förståelse av samspelet mellan torkastress, växtutveckling och epigenetik av sorghumväxter. Vårt tidigare arbete har visat starka kopplingar mellan växt- och rhizosfärmikrobiom vid torkacklimat och svar påmolekylär nivå 5,6,7. Denna forskning kommer att bana väg för att använda epigenetisk teknik för att anpassa grödor till framtida klimatscenarier. Som en del av arbetet med att förstå epigenetik strävar vi efter att studera proteinmarkörer som påverkar genuttrycket inom växtorganismen.
Histoner tillhör en mycket bevarad familj av proteiner i eukaryoter som packar DNA i nukleosomer som grundläggande enheter av kromatin. Post-translational ändringar (PTMs) av histones regleras dynamiskt för att kontrollera kromatin struktur och påverka gen uttryck. Liksom andra epigenetiska faktorer, inklusive DNA-metylering, spelar histon-PTM viktiga roller i många biologiska processer8,9. Antikroppsbaserade analyser som västerländska blots har i stor utsträckning använts för att identifiera och kvantifiera histon-PTM: er. Dessutom kan interaktionen mellan histon-PTMs och DNA effektivt undersökas av Chromatin immunoprecipitation – sekvensering (ChIP-seq)10. I ChIP-seq berikas kromatin med specifik riktad histon PTM av antikroppar mot den specifika PTM. Sedan kan DNA-fragmenten släppas ut från den berikade kromatin och sekvenseras. Regioner av gener som interagerar med den riktade histonen PTM avslöjas. Alla dessa experiment är dock starkt beroende av antikroppar av hög kvalitet. För vissa histonvarianter/homologer eller kombinationer av PTM kan utvecklingen av robusta antikroppar vara extremt utmanande (särskilt för flera PTM). Dessutom kan antikroppar endast utvecklas om den riktade histonen PTM är känd. 11 Därför är det nödvändigt med alternativa metoder för obefläckad, global profilering av histon-PTM: er.
Masspektrometri (MS) är en kompletterande metod för att karakterisera histon-PTM, inklusive okända PTM-skivor för vilka antikroppar inte ärtillgängliga 11,12. Det väletablerade “bottom-up” MS-arbetsflödet använder proteaser för att smälta proteiner till små peptider före vätskekromatografi (LC) separation och MS-detektion. Eftersom histoner har ett stort antal grundläggande rester (lysin och arginin), trypsin matsmältningen (proteas specifikt för lysin och arginin) i standard bottom-up arbetsflöde skär proteinerna i mycket korta peptider. De korta peptiderna är tekniskt svåra att analysera med standard LC-MS, och bevarar inte informationen om anslutning och stoichiometry av flera PTMs. Användningen av andra enzymer eller kemisk märkning för att blockera lysiner genererar längre peptider som är mer lämpliga för karakterisering av histon PTMs13,14.
Alternativt kan matsmältningssteget utelämnas helt. I denna “top-down” -metod introduceras intakta proteinjoner i MS genom elektrosprayjonisering (ESI) efter online LC-separation, vilket ger joner av de intakta histonproteoformerna. Dessutom kan joner (dvs. proteoformer) av intresse isoleras och fragmenteras i masspektrometern för att ge sekvensjonerna för identifiering och PTM-lokalisering. Därför har ms uppifrån och ned fördelen att bevara proteoform-nivåinformationen och fånga anslutningen av flera PTMs och terminal trunkeringar på samma proteoform15,16. Top-down experiment kan också ge kvantitativ information och erbjuda insikter om biomarkörer på intakt proteinnivå17. Här beskriver vi ett protokoll för att extrahera hisstone från sorghum leaf och analysera de intakta histonerna av top-down LC-MS.
De exempeldata som visas i figur 1 och figur 2 kommer från sorghumblad som samlats in vecka 2 efter plantering. Även om variation av avkastning förväntas, är detta protokoll i allmänhet agnostiskt för specifika prov villkor. Samma protokoll har framgångsrikt använts för sorghum växtbladsvävnad som samlats in från 2, 3, 5, 8, 9 och 10 veckor efter plantering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det presenterade protokollet beskriver hur man extraherar histoner från sorghumblad (eller mer allmänt växtblad) prover. Den genomsnittliga histonavkastningen förväntas vara 2–20 μg per 4–5 g sorghumbladmaterial. Materialen är tillräckligt rena för nedströms hisstensanalys av LC-MS (mestadels histoner med ~ 20% ribosomal proteinförorening). Lägre utbyte kan erhållas på grund av provvariationer eller potentiell felaktig hantering/fel i hela protokollet. Det är viktigt att upprätthålla kärnans integri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Ronald Moore och Thomas Fillmore för att de hjälpte till med masspektrometriexperiment och Matthew Monroe för datadeposition. Denna forskning finansierades genom bidrag från US Department of Energy (DOE) Biological and Environmental Research genom projektet Epigenetic Control of Drought Response in Sorghum (EPICON) under tilldelningsnummer DE-SC0014081, från USDA (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D) och genom Joint BioEnergy Institute (JBEI), en anläggning sponsrad av DOE (Contract DE-AC02-05CH11231) mellan Lawrence Berkeley National Laboratory och DOE. Forskningen utfördes med Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) (grid.436923.9), ett DOE Office of Science User Facility sponsrat av Office of Biological and Environmental Research.
Materials
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
- Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
- Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor – an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
- Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
- Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
- Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, 121-148 (2017).
- Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
- Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
- Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).
- Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
- Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, 153-168 (2017).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
- Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
- Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
- Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
- Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , (2019).
- Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
- Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
- Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
- Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
- Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).
