Potansiyel Epigenetik belirteçlerin Yukarıdan Aşağıya Kütle Spektrometresi Profillemi için Sorgum Yaprak Dokusundan Histone İzolasyonu
Summary
Protokol, kuraklığa dayanıklı ürünlerin mühendisliğine yardımcı olmak için potansiyel epigenetik belirteçler olarak hizmet edebilecek histone post-translational modifikasyonların profillenebilmesi için sorgum yaprağı malzemelerinden bozulmamış histonları etkili bir şekilde çıkarmak için geliştirilmiştir.
Abstract
Histonlar, ökaryotlarda yüksek oranda korunmuş protein ailesine aittir. DNA’yı fonksiyonel kromatin birimleri olarak nükleozomlara paketlerler. Son derece dinamik olan ve enzimler tarafından eklenebilen veya çıkarılabilen histonların çeviri sonrası modifikasyonları (PTM’ler) gen ekspresyonunun düzenlenmesinde kritik roller oynar. Bitkilerde, histone PTM’leri de dahil olmak üzere epigenetik faktörler, çevreye adaptif tepkileri ile ilgilidir. Epigenetik kontrolün moleküler mekanizmalarını anlamak, yenilikçi biyomühendislik çözümleri için benzeri görülmemiş fırsatlar getirebilir. Burada, çekirdeği izole etmek ve histonları sorgum yaprak dokusundan arındırmak için bir protokol açıklıyoruz. Çıkarılan histonlar, çevrimiçi ters fazlı (RP) sıvı kromatografisi (LC) ile birlikte yukarıdan aşağıya kütle spektrometresi (MS) ile bozulmamış formlarında analiz edilebilir. Aynı histone proteoformdaki birden fazla PTM’nin kombinasyonları ve stoichiometry kolayca tanımlanabilir. Ek olarak, histone kuyruk kırpması yukarıdan aşağıya LC-MS iş akışı kullanılarak algılanabilir, böylece çekirdek histonların (H4, H2A, H2B, H3) küresel PTM profilini elde eder. Bu protokolü daha önce, kuraklık direncinin epigenetik belirteçlerini tanımlamayı amaçlayan büyük ölçekli bir saha çalışmasından toplanan sorgum yaprak dokusundan histone PTM’lerinin profilini çıkarmak için uygulamiştik. Protokol potansiyel olarak kromatin immünorepipitasyon-dizileme (ChIP-seq) veya benzer bitkilerdeki histone PTM’lerini incelemek için uyarlanabilir ve optimize edilebilir.
Introduction
Artan kuraklık şiddeti ve sıklığının tahıl bitkilerinin verimliliğini etkilemesi bek edilmektedir1,2. Sorgum, su sınırlayıcı koşullara dayanma olağanüstü yeteneği ile bilinen bir tahıl gıda ve enerji mahsulüdür3,4. Kuraklık stresi, bitki gelişimi ve sorgumun epigenetiği [Sorgum çift renkli (L.) Moench] bitkileri arasındaki etkileşimi mekanistik bir şekilde anlamaya çalışıyoruz. Önceki çalışmalarımız kuraklık iklimlendirmesinde bitki ve rizosfer mikrobiyomu ile moleküler düzeyde5,6,7. Bu araştırma, bitkileri gelecekteki iklim senaryolarına uyarlamada epigenetik mühendisliğin kullanılmasının önünü açacaktır. Epigenetiği anlama çabalarının bir parçası olarak, bitki organizmasında gen ekspresyonını etkileyen protein belirteçlerini incelemeyi amaçlıyoruz.
Histonlar, ökaryotlarda DNA’yı kromatin temel birimleri olarak nükleozomlara paketleyen yüksek oranda korunmuş bir protein ailesine aittir. Histonların çeviri sonrası modifikasyonları (PTM’ ler) kromatin yapısını kontrol etmek ve gen ekspresyonunu etkilemek için dinamik olarak düzenlenir. DNA metilasyonu da dahil olmak üzere diğer epigenetik faktörler gibi, histone PTM’leri de birçok biyolojik işlemde önemli roller oynar8,9. Batı lekeleri gibi antikor bazlı tahliller, histone PTM’lerini tanımlamak ve ölçmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Ek olarak, histone PTM’lerinin ve DNA’nın etkileşimi Chromatin immünorepritasyon ile etkili bir şekilde araştırılabilir – sıralama (ChIP-seq)10. ChIP-seq’te, spesifik hedefli histone PTM’ye sahip kromatin, bu spesifik PTM’ye karşı antikorlarla zenginleştirilir. Daha sonra, DNA parçaları zenginleştirilmiş kromatinden serbest bırakılabilir ve sıralanabilir. Hedeflenen histone PTM ile etkileşime giren genlerin bölgeleri ortaya konmuştır. Bununla birlikte, tüm bu deneyler büyük ölçüde yüksek kaliteli antikorlara dayanır. Bazı histone varyantları / homologları veya PTM kombinasyonları için, sağlam antikorların geliştirilmesi son derece zor olabilir (özellikle birden fazla PTM için). Ek olarak, antikorlar ancak hedeflenen histone PTM biliniyorsa geliştirilebilir. 11 Bu nedenle, histone PTM’lerin hedefsiz, genel profil oluşturma için alternatif yöntemler gereklidir.
Kütle spektrometresi (MS), antikorların bulunmadığı bilinmeyen PTM’ler de dahil olmak üzere histone PTM’leri karakterize etmek için tamamlayıcı bir yöntemdir11,12. Köklü “aşağıdan yukarıya” MS iş akışı, sıvı kromatografi (LC) ayrımı ve MS algılamadan önce proteinleri küçük peptitlere sindirmek için proteaz kullanır. Histonlar çok sayıda temel kalıntıya (lizin ve arginin) sahip olduğundan, standart aşağıdan yukarıya iş akışındaki tripsin sindirimi (lizin ve arginin’e özgü proteaz) proteinleri çok kısa peptitlere keser. Kısa peptitlerin standart LC-MS tarafından analiz etmesi teknik olarak zordur ve birden fazla PTM’nin bağlantısı ve stoichiometry’si hakkındaki bilgileri korumaz. Lizinleri bloke etmek için diğer enzimlerin veya kimyasal etiketlemeninkullanılması,histone PTM’lerin karakterizasyonu için daha uygun olan daha uzun peptitler üretir13,14.
Alternatif olarak, sindirim adımı tamamen atlanabilir. Bu “yukarıdan aşağıya” yaklaşımda, bozulmamış protein iyonları, çevrimiçi LC ayrımından sonra elektrospray iyonizasyonu (ESI) ile MS’e sokulur ve bozulmamış histone proteoformlarının iyonlarını verir. Ek olarak, ilgi çekici iyonlar (yani proteoformlar), tanımlama ve PTM lokalizasyonu için sıra iyonlarını elde etmek için kütle spektrometresinde izole edilebilir ve parçalanabilir. Bu nedenle, yukarıdan aşağıya MS, proteoform düzeyindeki bilgileri koruma ve aynı proteoform15 , 16üzerindeki birden fazla PTM ve terminal kesilmelerinin bağlantısını yakalama avantajına sahiptir. Yukarıdan aşağıya deneyler ayrıca nicel bilgiler sağlayabilir ve bozulmamış protein seviyesindeki biyobelirteçlerin içgörülerini sunabilir17. Burada, sorgum yaprağından histone çıkarmak ve bozulmamış histonları yukarıdan aşağıya LC-MS ile analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz.
Şekil 1 ve Şekil 2’de gösterilen örnek veriler ekimden sonraki 2. haftada toplanan sorgum yaprağındandır. Verim değişimi beklenmekle birlikte, bu protokol genellikle belirli örnek koşullara göre belirsizdir. Aynı protokol, ekimden 2, 3, 5, 8, 9 ve 10 hafta sonra toplanan sorgum bitki yaprak dokusu için başarıyla kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan protokol, histonların sorgum yaprağı (veya daha genel olarak bitki yaprağı) örneklerinden nasıl çıkarılacağını açıklar. Ortalama histone veriminin 4-5 g sorgum yaprağı malzemesi başına 2-20 μg olması beklenebilir. Malzemeler, LC-MS tarafından aşağı akış histon analizi için yeterince saftır (çoğunlukla ~% 20 ribozomal protein kontaminasyonuna sahip histonlar). Örnek varyasyonlar veya protokol boyunca olası yanlış işlenme/arızalar nedeniyle daha düşük verim elde edilebilir. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ronald Moore ve Thomas Fillmore’a kütle spektrometresi deneylerine yardım ettiği için ve Matthew Monroe’ya veri ifadesi için teşekkür ederiz. Bu araştırma, ABD Tarım Bakanlığı’ndan (USDA) DE-SC0014081 ödül numarası altında Sorgum’da Kuraklık Tepkisinin Epigenetik Kontrolü (EPICON) projesi aracılığıyla ABD Enerji Bakanlığı (DOE) Biyolojik ve ÇevreSel Araştırmalar tarafından finanse edildi; CRIS 2030-21430-008-00D) ve Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı ile DOE arasında DOE (Contract DE-AC02-05CH11231) sponsorluğunda bir tesis olan Joint BioEnergy Institute (JBEI) aracılığıyla. Araştırma, Biyolojik ve Çevresel Araştırmalar Ofisi sponsorluğunda bir DOE Bilim Kullanıcı Tesisi Ofisi olan Çevre Moleküler Bilimler Laboratuvarı (EMSL) (grid.436923.9) kullanılarak gerçekleştirildi.
Materials
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
- Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
- Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor – an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
- Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
- Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
- Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, 121-148 (2017).
- Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
- Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
- Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).
- Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
- Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, 153-168 (2017).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
- Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
- Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
- Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
- Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , (2019).
- Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
- Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
- Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
- Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
- Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).
