Inkrementelle Temperaturänderungen für maximale Brut und Laichzeit bei Astyanax mexicanus
Summary
Dieser Artikel beschreibt die grundlegenden Laborbedingungen und Protokolle für ein inkrementelles Temperaturregime zur Stimulierung des maximalen Laichens beim mexikanischen Salmler Astyanax mexicanus, einem aufstrebenden Modell für Entwicklungs- und Evolutionsstudien.
Abstract
Der mexikanische Salmler Astyanax mexicanusist ein aufstrebendes Modellsystem für Entwicklungs- und Evolutionsstudien. Die Existenz von Augenoberflächen- (Oberflächenfischen) und blinden Höhlenmorphen (Höhlenfische) in dieser Art bietet die Möglichkeit, die Mechanismen zu hinterfragen, die der morphologischen und Verhaltensevolution zugrunde liegen. Höhlenfische haben neuartige konstruktive und regressive Eigenschaften entwickelt. Zu den konstruktiven Veränderungen gehören Eine Zunahme der Geschmacksknospen und Kiefer, der Sinnesorgane der Seitenlinie und des Körperfetts. Die regressiven Veränderungen umfassen den Verlust oder die Verringerung der Augen. Melaninpigmentierung, Schulverhalten, Aggression und Schlaf. Um diese Veränderungen experimentell zu untersuchen, ist es entscheidend, eine große Anzahl von erzeugten Embryonen zu erhalten. Seit die ursprünglichen A. mexicanus Oberflächenfische und Höhlenfische in den 1990er Jahren in Texas und Mexiko gesammelt wurden, wurden ihre Nachkommen routinemäßig dazu angeregt, zweimonatlich im Jeffery-Labor eine große Anzahl von Embryonen zu züchten und zu laichen. Obwohl die Zucht durch Nahrungsfülle und -qualität, Hell-Dunkel-Zyklen und Temperatur gesteuert wird, haben wir festgestellt, dass inkrementelle Temperaturänderungen eine Schlüsselrolle bei der Stimulierung des maximalen Laichens spielen. Der allmähliche Temperaturanstieg von 72 ° F auf 78 ° F in den ersten drei Tagen einer Brutwoche bietet zwei bis drei aufeinanderfolgende Laichtage mit einer maximalen Anzahl hochwertiger Embryonen, gefolgt von einem allmählichen Temperaturabfall von 78 ° F auf 72 ° F während der letzten drei Tage der Laichwoche. Die in diesem Video gezeigten Verfahren beschreiben den Arbeitsablauf vor und während einer Laborzuchtwoche für ein inkrementelles temperaturstimuliertes Laichen.
Introduction
Der Teleost Astyanax mexicanus hat eine augenbewohnende (Oberflächenfische) Form und viele verschiedene blinde Höhlenbewohner (Höhlenfische) Formen1,2. Höhlenfische haben sich in ständiger Dunkelheit und unter Nahrungsbeschränkungen entwickelt, was zum Auftreten neuartiger konstruktiver und regressiver Merkmale führt3. Zu den konstruktiven Merkmalen gehören eine Zunahme der Geschmacksknospen und der Kiefergröße, Sinnesorgane der Seitenlinie und Fettreserven. Zu den regressiven Merkmalen gehören der Verlust oder die Verringerung von Melaninpigmentierung, Augen und Verhaltensweisen wie Schlaf, Schulbildung und Aggression. Ein Attribut des Astyanax-Systems ist die vollständige Fruchtbarkeit zwischen den beiden Formen, die die Verwendung von quantitativen Trait Loci (QTL) ermöglicht, um die genomischen Regionen zu bestimmen, die mit der konstruktiven und regressiven Evolution verbunden sind4,5,6,7. A. mexicanus bietet ein vorteilhaftes System zur Untersuchung der Entwicklung, da es dazu gebracht werden kann, häufig im Labor zu laichen. Die Embryonen von A. mexicanus sind durchscheinend, etwas größer als die von Zebrafischen, werden in großen Mengen produziert und entwickeln sich in etwa 8-12 Monaten zu geschlechtsreifen Erwachsenen. Ihre Maximale Laichkapazität beträgt etwa 5 Jahre. Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf, der in einer A. mexicanus-Kulturanlage während einer typischen Brutwoche benötigt wird, und enthält die Details der Wartung des Fischsystems und des Temperaturkontrollregimes für maximales Laichen.
A. mexicanus ist ein tropischer Fisch, der in Flüssen lebt, die in Kalksteinplateaus (Oberflächenfische) und in Pools in Kalksteinhöhlen (Höhlenfische)entstehen 8. Kalkstein löst sich auf, um hartes Wasser zu produzieren, und A. mexicanus gedeiht in hartem Wasser. Fische, die an harte Wasserbedingungen angepasst sind, können eine Reihe von salzigen Bedingungen tolerieren, brüten aber im Allgemeinen in bestimmten9. Die Induktion des Laichverhaltens wird durch eine Kombination von Faktoren erreicht. Da Fische kaltblütig sind und auf ihre Umgebung angewiesen sind, um die Homöostase aufrechtzuerhalten, reagiert ihr Stoffwechsel empfindlich auf Umweltveränderungen und sie reagieren schneller auf Stressoren10. A. mexicanus sollte in aquatischen Systemen unter sorgfältig regulierten Bedingungen von Wasserfluss, pH-Wert, Leitfähigkeit, osmotischem Druck, Beleuchtung und Wassertemperaturen kultiviert werden.
Im Jeffery-Labor werden Fische in zwei fließenden Wassersystemen gehalten: (1) einem “Babysystem” für junge erwachsene Fische vor der Geschlechtsreife und (2) einem erwachsenen (oder Haupt-) System für geschlechtsreife, brütende Erwachsene. Das “Babysystem” besteht aus 8 L und 15 L Tanks, die mit fließendem Wasser versorgt werden. Das “Babysystem” wird von Jungfischen und jungen metamorphosisierten Jungtieren ausgesät, die aus Larven in kleineren (1-10 L) Tanks gezüchtet werden, in denen wöchentlich Wasser ausgetauscht wird. Larven, Jungtiere und Jungtiere sind extrem nahrungsabhängig und müssen einmal täglich mit Lebendfutter (Solegarnelen) gefüttert werden, um eine hohe Überlebensrate zu gewährleisten. Junge Jungtiere aus dem “Babysystem” werden nach etwa 1-1,5 Jahren in das Erwachsenensystem eingeordnet. Zuerst werden sie mit pulverisierten Tetraflocken gefüttert und nach weiterem Wachstum in das reguläre Fütterungsregime für Erwachsene überführt. Die Geschlechtsreife kann durch das Bauchvolumen bei Frauen beurteilt werden, und Methoden zur Bestimmung des Geschlechts wurden beschrieben11. Im Erwachsenensystem wird das Wasser automatisch in 42-L-Tanks 3 Mal pro 24-Stunden-Zeitraum ausgetauscht. Das Erwachsenensystem wird täglich durch visuelle Inspektion und automatische Temperatur-, pH- und Leitfähigkeitswerte von Sonden überwacht. Der optimale pH-Wert liegt bei etwa 7,4 und kann zwischen 6,8 und 7,5 liegen, die Basistemperatur des Systems beträgt 72/73 ° F und die ideale Leitfähigkeit liegt zwischen 600 und 800 mS. Automatische Messwerte werden auf einem Controller-Bildschirm angezeigt, und visuelle Überprüfungen des Wasserdrucks werden an Imgühlungsmessern abgelesen, die im gesamten System verteilt sind. Unabhängige Überprüfungen der Wasserqualität werden wöchentlich durchgeführt, indem die Temperatur getestet und die Wasserqualitätsparameter für pH-Wert, Ammoniak und Nitrat mit einem kolorimetrischen Test gemessen werden. Der Ammoniak- und Nitratgehalt wird auf oder nahe Null gehalten, indem dem System nützliche Bakterien (z. B. Nutafin Cycle) hinzugefügt werden. Die Raumbeleuchtung wird über einen Timer gesteuert, der auf 14-Stunden-Licht und 10-Stunden-Dunkelzeiten eingestellt ist. Zusätzlich zu den oben genannten allgemeinen Wasserqualitätsparametern müssen die folgenden Überlegungen während einer Brutwoche besonders beachtet werden.
Die erste Überlegung ist die Photoperiode, da Fische (sogar Höhlenfische im Labor) auf Lichtzyklen angewiesen sind, um ihre zirkadiane Uhr einzustellen. Circadiane Rhythmen können alles von der Zucht und Fütterung bis hin zur Gesundheit des Immunsystemsbeeinflussen 12,13 und müssen für maximale gesundheitliche Vorteile konsistent sein. Fische werden in einem Flaufwassersystem auf einer 14-stündigen hellen und 10-stündigen dunklen Fotoperiode gehalten. Die Oberflächenfische beginnen im Allgemeinen eine Stunde nach der Verdunkelung des Systems mit dem Laichen, und das während dieser Zeit eingebrachte Licht kann das Laichen stören und beenden. Das Laichen blinder Höhlenfische wird weniger durch Licht gestört. Im Vergleich zum Laichen von Oberflächenfischen verzögert sich das Laichen von Höhlenfischen und beginnt in der Regel vier bis fünf Stunden nach der Verdunkelung des Systems.
Die zweite Überlegung ist die Ernährung. Erwachsene Fische werden normalerweise einmal täglich mit Tetraflocken gefüttert. Vor dem Laichen werden Fische mit einer proteinreichen Diät gefüttert, die mit zusätzlichen Mengen an Tetraflocken und anderen Lebensmitteln ergänzt wird: Eigelbflocken und gelegentlich lebende kalifornische Schwarzwürmer (Lumbriculus variegatus), um den Proteinverlust aufgrund der Eierproduktion während des vorherigen Laichzyklus auszugleichen. Während der Brutwoche werden die Fische zweimal täglich gefüttert, einmal morgens und wieder nachmittags/abends. Fischfütterung nur einmal täglich, aber mit einer einzigen sehr großen Portion Futter sollte vermieden werden, da dies zu Unterernährung führen kann14.
Die dritte Überlegung ist der Raum. Der Platzbedarf basiert auf der durchschnittlichen Körpermasse eines Erwachsenen sowie Verhaltensüberlegungen, z. B. ob die Fische Schwarmverhalten oder aggressives Verhalten haben. Über- oder unterfüllte Tanks können zu erhöhter Aggression und ständigem Stress führen, was Fische anfällig für Verletzungen durch ihre Tankkameraden macht und nur ungern am Laichen teilnimmt15. Wir beherbergen normalerweise 10-20 Fische pro 42 L Tank.
Die vierte Überlegung ist die Temperatur. Wie oben erwähnt, sind Fische kaltblütige Tiere und auf die Umwelt angewiesen, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Da die Temperatur einen direkten Einfluss auf Stoffwechselprozesse hat, können Temperaturänderungen Verhaltensänderungen bei Fischen auslösen16. Dieses Zuchtprogramm besteht aus zweiwöchigen Temperaturzyklen: Die erste Woche führt zu einem Temperaturanstieg von 78 ° F und die nächste Woche zu einer statischen Temperatur von 72 ° F. Während der ersten (Brut-)Woche werden jeden Abend kunststoffumrandige Zuchtnetze am Boden der Becken platziert. Die Brutnetze dienen als Barriere zwischen den Fischen in den Becken und den laichen Eiern, die sonst verzehrt würden. Die Temperatur wird bis Mitte der Woche um 2 ° F pro Tag auf maximal 78 ° F erhöht, und das Laichen wird entsprechend dem Lichtzyklus in den ersten 2-3 Abenden dieser Woche induziert. Die Temperatur wird dann an den verbleibenden Tagen der Woche um 2 ° F auf 72 ° F gesenkt, und die Basistemperatur wird bis zum Beginn der nächsten Brutwoche beibehalten. Die Zucht wird in der Regel nicht mehr als zweimal im Monat stimuliert, damit sich die Fische erholen können.
Insgesamt ermöglicht diese Methode das Laichen großer Mengen hochwertigster Embryonen über einen längeren Zeitraum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Astyanax mexicanus ist ein neuartiges biologisches Modell, das häufig laicht und leicht im Labor gezüchtet werden kann1,2. Da wir uns für die Entwicklungsmechanismen interessieren, die evolutionären Veränderungen bei A. mexicanus-Höhlenfischen zugrunde liegen, ist die Produktion und Verwendung von Embryonen für unsere Forschungsziele von entscheidender Bedeutung. Der Hauptzweck der Erhaltung eines erwachsenen Fischbestandes ist die Produk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken David Martasian, Diedre Heyser, Amy Parkhurst, Craig Foote und Mandy Ng für wertvolle Beiträge zur Kultureinrichtung des Jeffery-Labors A. mexicanus. Die Forschung im Jeffery-Labor wird derzeit durch den NIH-Zuschuss EY024941 unterstützt.
Materials
| Blackworms | Eastern Aquatics, Lancaster, PA | None | |
| Breeding Nets | Custom made | ||
| Brine shrimp eggs | AquaCave Lake Forest, IL. | None | |
| Colorimetric test kit | Petco | SKU:11916 | API Freshwater pH Test Kit |
| Egg yolk flakes | Pentair, Minneapolis, MN | None | |
| Fingerbowls | Carolina Biological Supply | 741004 | Culture dishes, 4.5 in, 250 mL |
| Hand held nets | Any Pet Store | ||
| Incubator for embryos | Fisher Scientific | 51-029-321HPM | 405 L |
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M9140 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20 | 5.75 in. |
| Net soaking solution | Any Pet Store | ||
| Nutrafin Cycle | Amazon | None | Bacterial boost |
| Refrigerator for live feed | Any source | ||
| Stereomicroscope | Any source | ||
| Thermometer | Any source | ||
| Tetra Tropical Crisps | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None |
References
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