Trinnvise temperaturendringer for maksimal avl og gyting i Astyanax mexicanus

Summary

Denne artikkelen skisserer de grunnleggende laboratorieforholdene og protokollene for et inkrementelt temperaturregime for å stimulere maksimal gyting i den meksikanske tetra Astyanax mexicanus, som er en ny modell for utviklingsmessige og evolusjonære studier.

Abstract

Den meksikanske tetra, Astyanax mexicanus, er et fremvoksende modellsystem for studier i utvikling og evolusjon. Eksistensen av øyeoverflate (overflatefisk) og blind hule (hulefisk) morphs i denne arten presenterer en mulighet til å forhøre mekanismene som ligger til grunn for morfologisk og atferdsmessig evolusjon. Hulefisk har utviklet nye konstruktive og regressive egenskaper. De konstruktive endringene inkluderer økning i smaksløker og kjever, laterale linjesensoriske organer og kroppsfett. De regressive endringene inkluderer tap eller reduksjon av øyne. melaninpigmentering, skolegang, aggresjon og søvn. For å eksperimentelt forhøre disse endringene, er det avgjørende å oppnå et stort antall gytede embryoer. Siden den opprinnelige A. mexicanus overflatefisk og hulefisk ble samlet i Texas og Mexico på 1990-tallet, har deres etterkommere rutinemessig blitt stimulert til å avle og gyte et stort antall embryoer tomånedert i Jeffery-laboratoriet. Selv om avl styres av matoverflod og kvalitet, lyse mørke sykluser og temperatur, har vi funnet ut at inkrementelle temperaturendringer spiller en nøkkelrolle i å stimulere maksimal gyting. Den gradvise temperaturøkningen fra 72 °F til 78 °F i de tre første dagene av en avlsuke gir to-tre påfølgende gytedager med maksimalt antall embryoer av høy kvalitet, som deretter etterfølges av en gradvis temperaturreduksjon fra 78 °F til 72 °F i løpet av de siste tre dagene av gyteuken. Prosedyrene som vises i denne videoen skisserer arbeidsflyten før og under en laboratorieavlsuke for trinnvis temperatur stimulert gyting.

Introduction

Teleost Astyanax mexicanus har en øye overflate-bolig (overflate fisk) form og mange forskjellige blinde hule-bolig (hule fisk) danner^1,2. Hulefisk har utviklet seg i evig mørke og under matbegrensninger, noe som resulterer i utseendet på nye konstruktive og regressive egenskaper³. De konstruktive egenskapene inkluderer økning i smaksløker og kjevestørrelse, sensoriske organer i sidelinjen og fettreserver. De regressive egenskapene inkluderer tap eller reduksjon av melaninpigmentering, øyne og atferd, for eksempel søvn, skolegang og aggresjon. Et attributt for Astyanax-systemet er fullstendig fruktbarhet mellom de to formene, slik at bruk av kvantitativ egenskap loci (QTL) kartlegging for å bestemme genomiske regionen(e) knyttet til konstruktiv og regressiv evolusjon^4,5,6,7. A. mexicanus tilbyr et fordelaktig system for å studere utvikling fordi det kan induseres til å gyte ofte i laboratoriet. Embryoene til A. mexicanus er gjennomsiktige, litt større enn sebrafisk, produsert i store mengder, og utvikler seg til seksuelt modne voksne på ca 8-12 måneder. Deres periode med maksimal gytekapasitet er ca 5 år. Denne protokollen beskriver arbeidsflyten som trengs i et A. meksikansk kulturanlegg i løpet av en typisk avlsuke og inkluderer detaljer om vedlikehold av fiskesystemet og temperaturkontrollregimet for maksimal gyting.

A. mexicanus er en tropisk fisk som bor i elver med opprinnelse i kalksteinsplatåer (overflatefisk) og i bassenger i kalksteinsgrotter (hulefisk)⁸. Kalkstein oppløses for å produsere hardt vann, og A. mexicanus trives i hardt vann. Fisk tilpasset harde vannforhold kan tolerere en rekke salte forhold, men generelt avle i spesifikke⁹. Induksjon av gyteadferd oppnås ved en kombinasjon av faktorer. Fordi fisk er kaldblodige og er avhengige av deres miljø for å opprettholde homeostase, er stoffskiftet følsomt for miljøendringer, og de reagerer raskere på stressorer¹⁰. A. mexicanus bør dyrkes i vannsystemer under nøye regulerte forhold for vannstrøm, pH, konduktivitet, osmotisk trykk, belysning og vanntemperaturer.

I Jeffery-laboratoriet opprettholdes fisk i to rennende vannsystemer: (1) et “babysystem” for ung voksenfisk før seksuell modenhet og (2) et voksent (eller hoved) system for seksuelt modne, avl voksne. “Babysystemet” består av 8 L og 15 L tanker som leveres med rennende vann. “Babysystemet” er sådd av yngel og unge metamorfoserte ungdommer dyrket fra larver i mindre (1-10 L) tanker, hvor vann utveksles ukentlig. Larver, yngel og ungdommer er ekstremt matavhengige og må mates levende mat (saltlake reker) en gang om dagen for å sikre en høy overlevelse. Unge ungdommer fra “babysystemet” plasseres i voksensystemet etter ca 1-1,5 år. Først blir de matet pulveriserte tetraflak, og etter videre vekst overføres de til det vanlige voksenfôringsregimet. Seksuell modenhet kan vurderes ved abdominal volum hos kvinner, og metoder for å bestemme kjønn har blitt beskrevet¹¹. I voksensystemet byttes vann automatisk i 42 L tanker 3 ganger per 24-timers periode. Voksensystemet overvåkes daglig ved visuell inspeksjon og automatisk temperatur, pH og konduktivitetsavlesninger fra sonder. Den optimale pH er rundt 7,4 og kan variere mellom 6,8-7,5, systemets basistemperatur er 72/73 °F, og de ideelle ledningsevneområdene mellom 600-800 mS. Automatiske avlesninger vises på en kontrollerskjerm, og visuelle kontroller av vanntrykk leses ved strømningsmålere fordelt over hele systemet. Uavhengige kontroller av vannkvaliteten gjøres ukentlig ved å teste temperatur og måle vannkvalitetsparametere for pH, ammoniakk og nitrat ved hjelp av en kolorimetrisk test. Ammoniakk- og nitratnivåer holdes på eller nær null ved å tilsette gunstige bakterier (f.eks. Nutafin Cycle) til systemet. Rombelysning styres av en timer justert til 14-timers lys og 10-timers mørke perioder. I tillegg til de generelle vannkvalitetsparametrene nevnt ovenfor, trenger følgende hensyn spesiell oppmerksomhet i løpet av en avlsuke.

Den første vurderingen er fotoperiod, da fisk (til og med hulefisk i laboratoriet) er avhengig av lyssykluser for å stille inn døgnklokken. Døgnrytmer kan påvirke alt fra avl og fôring til immunsystemhelse^12,13 og må være konsistent for maksimale helsemessige fordeler. Fisk opprettholdes i et rennende vannsystem på en 14-timers lys og 10-timers mørk fotoperiod. Overflatefisken begynner vanligvis å gyte en time etter at systemet er mørklagt, og lys introdusert i denne perioden kan forstyrre og avslutte gyting. Gytingen av blind hulefisk er mindre forstyrret av lys. Sammenlignet med gyting av overflatefisk, er hulefiskgyting forsinket, vanligvis begynner fire til fem timer etter at systemet har blitt mørkt.

Den andre vurderingen er ernæring. Voksenfisk blir normalt matet en diett av tetraflak en gang om dagen. Før gyting blir fisk matet et proteinrikt kosthold supplert med ekstra mengder tetraflak og annen mat: eggeplommeflak og av og til levende California blackworms (Lumbriculus variegatus) for å kompensere for proteintap på grunn av eggproduksjon i løpet av forrige gytesyklus. I avlsuken blir fisk matet to ganger per dag, en gang om morgenen og igjen om ettermiddagen / kvelden. Fiskefôring bare en gang om dagen, men med en enkelt veldig stor del av maten bør unngås, da dette kan forårsake underernæring¹⁴.

Det tredje hensynet er plass. Plasskravene er basert på den gjennomsnittlige kroppsmassen til en voksen, samt atferdshensyn, for eksempel om fisken har skolegangsadferd eller aggressiv oppførsel. Over- eller under-crowding tanker kan føre til økt aggresjon og konstant stress, noe som gjør fisk sårbar for skade fra sine tankkamerater og motvillig til å delta i gyting¹⁵. Vi huser vanligvis 10-20 fisk per 42 L tank.

Det fjerde hensynet er temperatur. Som nevnt ovenfor er fisk kaldblodige dyr og er avhengige av miljøet for å opprettholde kroppstemperaturen. Fordi temperatur har en direkte effekt på metabolske prosesser, kan temperaturendringer utløse atferdsendringer hos fisk¹⁶. Dette avlsprogrammet består av to ukers sykluser i temperatur: Den første uken introduserer en temperaturøkning til 78 °F, og neste uke opprettholder en statisk temperatur på 72 °F. I løpet av den første (avls) uken plasseres plastkantede avlsnett på bunnen av tankene hver kveld. Avlsnettene tjener som en barriere mellom fisken i tankene og de gytede eggene, som ellers ville bli konsumert. Temperaturen økes med 2 °F per dag til maksimalt 78 °F innen midten av uken, og gytingen induseres i henhold til lyssyklusen de første 2-3 kveldene denne uken. Temperaturen senkes deretter med trinn på 2 °F til 72 °F i løpet av de resterende dagene i uken, og basistemperaturen opprettholdes til begynnelsen av neste avlsuke. Avl stimuleres vanligvis ikke mer enn to ganger i måneden for å gi fisken tid til å gjenopprette.

Totalt sett tillater denne metoden gyting av store mengder av embryoer av høyeste kvalitet over en lengre periode.

Protocol

Denne prosedyren er godkjent av institusjonelle retningslinjer for dyrepleie ved University of Maryland, College Park (For tiden IACUC 469 #R-NOV-18-59; Prosjekt 1241065-1). Figur 1. Kalendere i løpet av en avlsuke og en ikke-avlsuke. Klikk her for å se en større versjon …

Representative Results

Vi avler og gyter vanligvis etterkommerne av overflatefisk som opprinnelig ble samlet på Nacimiento del Rio Choy i San Luis Potosi, Mexico (Rio Choy overflatefisk) og San Solomon Springs i Balmorhea State Park, Texas (Texas overflatefisk) og hulefisk avledet fra Cueva de El Pachón (Pachón hulefisk) i Tamaulipas, Mexico og Cueva de los Sabinos (Los Sabinos hulefisk) og Sotano de la Tinaja (Tinaja hulefisk) i San Luis Potosi Mexico. Gjennom en avlsuke samles det inn data for ulike tanker. De …

Discussion

Astyanax mexicanus er en ny biologisk modell som gyter ofte og kan avles lett i laboratoriet^1,2. Fordi vi er interessert i utviklingsmekanismene som ligger til grunn for evolusjonære endringer i A. mexicanus hulefisk, er produksjon og bruk av embryoer avgjørende for våre forskningsmål. Hovedformålet med å opprettholde en voksen bestand av fisk er produksjon av embryoer og ung yngel til bruk i utviklingseksperimenter og for etterfylling av …

Materials

Blackworms	Eastern Aquatics, Lancaster, PA	None
Breeding Nets	Custom made
Brine shrimp eggs	AquaCave Lake Forest, IL.	None
Colorimetric test kit	Petco	SKU:11916	API Freshwater pH Test Kit
Egg yolk flakes	Pentair, Minneapolis, MN	None
Fingerbowls	Carolina Biological Supply	741004	Culture dishes, 4.5 in, 250 mL
Hand held nets	Any Pet Store
Incubator for embryos	Fisher Scientific	51-029-321HPM	405 L
Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands, Blacksburg, VA	None
Methylene Blue	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M9140
Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20	5.75 in.
Net soaking solution	Any Pet Store
Nutrafin Cycle	Amazon	None	Bacterial boost
Refrigerator for live feed	Any source
Stereomicroscope	Any source
Thermometer	Any source
Tetra Tropical Crisps	Spectrum Brands, Blacksburg, VA	None