Lysarkbaseret fluorescensmikroskopi er det mest værdifulde værktøj inden for udviklingsbiologi. Et vigtigt spørgsmål i sammenlignende undersøgelser er variansen i omgivelserne. Vores protokol beskriver en eksperimentel ramme for samtidig live billeddannelse af flere prøver og behandler derfor dette problem proaktivt.
Lysarkbaseret fluorescensmikroskopi tilbyder effektive løsninger til at studere komplekse processer på flere biologisk relevante skalaer. Prøvekammerbaserede opsætninger, der er specielt designet til at bevare prøvens tredimensionelle integritet og normalt har prøverotation, er det bedste valg inden for udviklingsbiologi. For eksempel er de blevet brugt til at dokumentere hele den embryonale morfogenese af frugtfluen Drosophila melanogaster og den røde melbille Tribolium castaneum. Mange tilgængelige protokoller for levende billeddannelse giver dog kun eksperimentelle rammer for enkelte embryoner. Især for sammenlignende undersøgelser er sådanne tilgange ubelejlige, da sekventielt afbildede prøver påvirkes af omgivende varians. Desuden begrænser dette antallet af prøver, der kan analyseres inden for en given tid. Vi tilbyder en eksperimentel ramme for samtidig live billeddannelse, der øger gennemstrømningen i prøvekammerbaserede opsætninger og dermed sikrer lignende omgivende forhold for alle prøver. For det første giver vi en kalibreringsretningslinje for lysark fluorescensmikroskoper. For det andet foreslår vi en monteringsmetode for flere embryoner, der er forenelig med prøverotation. For det tredje leverer vi eksemplariske tredimensionelle live imaging datasæt af Drosophila, som vi sidestiller tre transgene linjer med fluorescerende mærket kerner, såvel som af Tribolium, for hvilke vi sammenligner udførelsen af tre transgene underlinjer, der bærer den samme transgener, men på forskellige genomiske steder. Vores protokol er specielt designet til sammenlignende undersøgelser, da den proaktivt adresserer omgivende varians, som altid er til stede i sekventiel live billeddannelse. Dette er især vigtigt for kvantitative analyser og karakterisering af aberrationelle fænotyper, som f.eks. Desuden øger det den samlede gennemløb, hvilket er meget bekvemt, når adgangen til lysark fluorescens mikroskoper er begrænset. Endelig kan den foreslåede monteringsmetode tilpasses andre insektarter og yderligere modelorganismer, f.eks.
Fluorescensmikroskopi er en af de mest essentielle billeddannelsesteknikker inden for biovidenskab, især i celle- og udviklingsbiologi. I confocal fluorescens mikroskoper1, som er state-of-the-art for tre-dimensionelle fluorescens billeddannelse siden midten af 1990’erne, den samme linse bruges til fluorophore excitation og emission lys afsløring. Belysningslaserstrålen ophidser alle fluorophorer langs belysnings-/detektionsaksen, og det respektive signal uden for fokus skelnes, inden det registreres af et pinhole. Derfor er hele prøven for hvert todimensionelt billede belyst. Derfor, for hver tre-dimensionelle billede, dvs en stak rumligt fortløbende to-dimensionelle billeder, hele prøven er belyst flere dusin til et par hundrede gange2, som fremmer photobleaching og fototoksicitet3.
For næsten tyve år siden fremstod lysarkbaseret teknologi4 som et lovende alternativ til tredimensionel fluorescensbilleddannelse og blev dermed et værdifuldt værktøj i udviklingsbiologi5. I denne tilgang afkobles belysning og detektion. Belysningslinsen bruges til at generere et lysark med en dybde på kun få mikrometer inden for brændplanet for den vinkelret arrangerede detektionslinse. Derfor er der for hvert todimensionelt billede kun et tyndt planarvolumen omkring brændplanet, der belyses. Derfor belyses hele prøven kun én gang for hvert tredimensionelt billede, hvilket stærkt reducerer fotobleaching og fototoksicitet6. Af denne grund tilbyder lysplade fluorescensmikroskoper (LSFMs) effektive løsninger til at studere komplekse processer på flere biologisk relevante skalaer og er derfor af særlig værdi i udviklingsbiologi, hvor prøver så store som flere millimeter skal analyseres på subcellulært niveau.
Historisk set har LSFMs været prøve kammer-baserede7,8. I disse opsætninger er belysnings- (x) og detektionsakserne (z) normalt arrangeret vinkelret på tyngdekraftsaksen (y). Prøvekamre giver rigelig eksperimentel frihed. For det første giver de en stor billedbufferkapacitet, hvilket igen letter brugen af et perfusionssystem til at kontrollere miljøet, f.eks. Desuden understøtter de tilpassede monteringsmetoder10, der er skræddersyet til de respektive eksperimentelle behov, samtidig med at de bevarer prøvens tredimensionelle, i nogle tilfælde dynamiske11, integritet. Derudover er prøvekammerbaserede opsætninger normalt udstyret med en rotationsfunktion, der bruges til at dreje prøverne omkring y-aksen og dermed afbilde dem langs to, fire eller endnu flere retninger. Da embryoner af almindeligt anvendte modelorganismer i forbindelse med mikroskopi er relativt store, giver successive billeder langs ventral-dorsale, laterale og/eller forreste bageste kropsakser en mere omfattende repræsentation. Dette giver f.eks. mulighed for langsigtet sporing af celler, der bevæger sig langs komplekse tredimensionale overflytningsstier12,13.
Lysarkbaseret fluorescensmikroskopi er blevet anvendt i vid udstrækning til at studere Drosophila melanogastersembryonale morfose , både systematisk14,15 samt med et specifikt fokus på de biofysiske aspekter af udvikling. For eksempel blev det brugt til at indsamle morfogenetiske data i høj opløsning for at opdage en biomekanisk forbindelse mellem endoderm invagination og akseudvidelse under kimbåndsforlængelse16 og yderligere for at relatere det komplekse cellulære flow med kraftgenereringsmønstre under gastrulation17. Det er også blevet kombineret med andre state-of-the-art teknikker, f.eks optogenetics at undersøge reguleringen af Wnt signalering under forreste-posterior mønstre i epidermis18.
Men at studere kun en art giver ikke indsigt i udviklingen af udviklingen. For at forstå embryogenese i den fylogenetiske kontekst er der udført intensiv forskning med alternative insektmodelorganismer. En af de mest omfattende undersøgte arter er den røde melbille Tribolium castaneum, et økonomisk relevant opbevaret korn skadedyr19, hvis embryonale morfogenese også allerede er blevet systematisk afbildet med LSFM20. Den embryonale morfogenese af disse to arter adskiller sig bemærkelsesværdigt i flere aspekter,f.eks. Sidstnævnte aspekt er allerede blevet grundigt analyseret ved hjælp af LSFMs. For eksempel har det vist sig, at serosa, et ekstra embryonalt væv, der omslutter og beskytter Tribolium-embryoet mod forskellige farer for det meste af dets embryogenese23,24, også fungerer som den morfogenetiske “driver” til sin egen tilbagetrækningsproces under dorsal lukning25. Endvidere er det blevet påvist, at en bestemt region af blastoderm under gastrulation forbliver forankret i vitellinemembranen for at skabe asymmetriske vævsbevægelser26 og efter denne observation, at regionaliseret vævsvæske gør det muligt for celler at sekventielt forlade serosakanten under serosavinduelukning27.
I alle ovennævnte Drosophila-og Tribolium-relateredeundersøgelser er der anvendt prøvekammerbaserede LSFMs. I de fleste blev embryonerne registreret i flere retninger ved hjælp af prøverotationsfunktionen. Selvom det ikke udtrykkeligt er angivet, kan det antages, at de er blevet registreret individuelt og dermed uafhængige af hinanden i sekventielle live billedanalyseanalyser, svarende til vores tidligere arbejde med Tribolium20,28. I visse scenarier er en sådan fremgangsmåde acceptabel, men især i kvantitative komparative tilgange kan variansen fordreje resultaterne. For eksempel har det længe været kendt, at insekternes udviklingshastighed er temperaturafhængig29, men en nyere undersøgelse tyder yderligere på, at temperaturen i Drosophilaogså kan påvirke koncentrationen af morfogener30. Hvis visse karakteristika ved embryogenese, f.eks. Dette minimerer standardafvigelser og standardfejl, hvilket igen letter sammenstilling med andre, selv bare marginalt divergerende eksperimentelle forhold.
Prøvekammerbaserede LSFM’er er dog primært designet til højt indhold i stedet for høje gennemløbsanalyser. I modsætning til konfokale mikroskoper, som typisk er udstyret med standardiserede klemmemekanismer til mikroskopidias, petriskåle og brøndplader, bruger næsten alle prøvekammerbaserede LSFM’er cylinderbaserede klemmemekanismer. Disse mekanismer er beregnet til specialfremstillede prøveholdere , der er rotationskompatible såvel som ikke-invasive10, men som normalt ikke er designet til mere end én prøve20,31,32. En ramme for samtidig levende billeddannelse af to eller flere embryoner, hvor fordelene ved prøvekammerbaserede opsætninger ikke kompromitteres, tager fat på spørgsmålet om omgivende varians og øger dermed værdien af LSFM’er til sammenlignende undersøgelser.
I vores protokol præsenterer vi en eksperimentel ramme for sammenlignende levende billeddannelse i prøvekammerbaserede LSFM’er (Figur 1A), hvor y-aksen bruges som en mulighed for at “stable” embryoner. For det første leverer vi en fluorescerende mikrosfærebaseret kalibreringsretningslinje for prøvekammerbaserede LSFM’er, hvilket er særligt vigtigt for instrumenter, der mangler en kalibreringsassistent. For det andet beskriver vi en monteringsmetode for flere embryoner baseret på spindelvævsholderen28 (Figur 1B),der er kompatibel med prøverotation og dermed giver mulighed for samtidig billeddannelse af flere prøver langs flere retninger (Figur 1C). Flere embryoner er justeret oven på en tynd agarosefilm og flyttede efter indsættelse i prøvekammeret successivt gennem lysarket for at erhverve tredimensionelle billeder. For det tredje leverer vi tre eksemplariske live billeddatasæt til Drosophila såvel som til Tribolium. For førstnævnte sidestiller vi transgene linjer med fluorescerende mærkede kerner. For sidstnævnte sammenligner vi ydeevnen af transgene underlinjer, der bærer den samme transgen, men på forskellige genomiske steder. Endelig diskuterer vi betydningen af parallelisering med hensyn til sammenlignende levende billeddannelse og omgivende varians33, diskuterer gennemløbsgrænsen for vores eksperimentelle ramme og evaluerer tilpasningen af vores tilgang til andre modelorganismer.
Et af LSFMs eksklusive anvendelsesområder er udviklingsbiologi. I denne disciplin er det vigtigt at se på levende prøver, ellers kan morfogenetiske processer ikke beskrives på en dynamisk måde. En eksperimentel ramme for den samtidige levende billeddannelse i prøvekammerbaserede LSFM’er, som beskrevet her, er praktisk af to hovedårsager.
Omgivende varians, som er uundgåelig i sekventiel live billeddannelse, kan behandles proaktivt. I insektfoster-associeret levende billeddannelse ser v…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Ernst H. K. Stelzer for muligheden for at bruge hans ressourcer samt hans værdifulde kommentarer vedrørende manuskriptet, Anita Anderl for støtte med Tribolium live imaging, Sven Plath for teknisk support samt Ilan Davis, Nicole Grieder og Gerold Schubiger for at dele deres transgene Drosophila linjer via Bloomington Stock Center.
6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
100-µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
250-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
300-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
710-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
800-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | Only for live imaging involving Tribolium |
low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |