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생물학

Gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Insektenembryonen in probenkammerbasierten Lichtbogenfluoreszenzmikroskopen

Published: September 09, 2020
doi:
10.3791/61713
, ,
1Physical Biology/Physikalische Biologie (IZN, FB15), Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes (CEF – MC),Goethe-Universität

Summary

Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie ist das wertvollste Werkzeug in der Entwicklungsbiologie. Ein wichtiges Thema in vergleichenden Studien ist die Varianz der Umgebung. Unser Protokoll beschreibt ein experimentelles Framework für die gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Proben und befasst sich daher proaktiv mit diesem Problem.

Abstract

Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie bietet effiziente Lösungen, um komplexe Prozesse auf mehreren biologisch relevanten Skalen zu untersuchen. Probenkammer-basierte Setups, die speziell entwickelt wurden, um die dreidimensionale Integrität der Probe zu erhalten und in der Regel Probenrotation aufweisen, sind die beste Wahl in der Entwicklungsbiologie. Zum Beispiel wurden sie verwendet, um die gesamte embryonale Morphogenese der Fruchtfliege Drosophila melanogaster und des Rotmehlkäfers Tribolium castaneumzu dokumentieren. Viele verfügbare Live-Bildgebungsprotokolle bieten jedoch nur experimentelle Frameworks für einzelne Embryonen. Gerade bei Vergleichsstudien sind solche Ansätze unbequem, da sequenzielle abgebildete Proben von der Umgebungsvarianz beeinflusst werden. Darüber hinaus begrenzt dies die Anzahl der Proben, die innerhalb einer bestimmten Zeit untersucht werden können. Wir bieten einen experimentellen Rahmen für die gleichzeitige Live-Bildgebung, der den Durchsatz in Probenkammer-basierten Setups erhöht und somit ähnliche Umgebungsbedingungen für alle Proben gewährleistet. Zunächst bieten wir eine Kalibrierrichtlinie für Lichtbogenfluoreszenzmikroskope an. Zweitens schlagen wir eine Montagemethode für mehrere Embryonen vor, die mit der Probenrotation kompatibel ist. Drittens bieten wir beispielhafte dreidimensionale Live-Imaging-Datensätze von Drosophila, für die wir drei transgene Linien mit fluoreszierend markierten Kernen sowie von Triboliumgegenüberstellen, für die wir die Leistung von drei transgenen Sublinien vergleichen, die dasselbe Transgen tragen, aber an verschiedenen genomischen Stellen. Unser Protokoll wurde speziell für vergleichende Studien entwickelt, da es proaktiv die Umgebungsvarianz anspricht, die immer in der sequenziellen Live-Bildgebung vorhanden ist. Dies ist besonders wichtig für quantitative Analysen und Die Charakterisierung von aberrationalen Phänotypen, die z.B. aus Knockout-Experimenten resultieren. Darüber hinaus erhöht es den Gesamtdurchsatz, was sehr praktisch ist, wenn der Zugang zu Lichtblattfluoreszenzmikroskopen begrenzt ist. Schließlich kann die vorgeschlagene Montagemethode für andere Insektenarten und weitere Modellorganismen, z.B. Zebrafische, ohne Optimierungsaufwand angepasst werden.

Introduction

Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine der wichtigsten bildgebenden Verfahren in den Biowissenschaften, insbesondere in der Zell- und Entwicklungsbiologie. Bei konfokalen Fluoreszenzmikroskopen1, die seit Mitte der 1990er Jahre auf dem Stand der dreidimensionalen Fluoreszenz-Bildgebung sind, wird dieselbe Linse für die Fluorophorerregung und Dieerkennung von Emissionslicht verwendet. Der Beleuchtungslaserstrahl regt alle Fluorophore entlang der Beleuchtungs-/Detektionsachse an und das jeweilige Out-of-Fokus-Signal wird vor der Erkennung durch ein Loch diskriminiert. Somit wird für jedes zweidimensionale Bild die gesamte Probe beleuchtet. Folglich wird für jedes dreidimensionale Bild, d.h. ein Stapel räumlich aufeinander folgender zweidimensionaler Bilder, die gesamte Probe mehrere Dutzend bis einige hundert mal2beleuchtet, was Photobleichungen und Phototoxizität3fördert.

Vor fast zwanzig Jahren entwickelte sich die Lichtbogentechnologie4 als vielversprechende Alternative zur dreidimensionalen Fluoreszenz-Bildgebung und wurde so zu einem wertvollen Werkzeug in der Entwicklungsbiologie5. Dabei werden Beleuchtung und Erkennung entkoppelt. Die Beleuchtungslinse wird verwendet, um eine Lichtplatte mit einer Tiefe von nur wenigen Mikrometern innerhalb der Brennebene der senkrecht angeordneten Detektionslinse zu erzeugen. Daher wird für jedes zweidimensionale Bild nur ein dünnes planares Volumen um die Brennebene beleuchtet. Folglich wird für jedes dreidimensionale Bild die gesamte Probe nur einmal beleuchtet, was die Photobleaching und Phototoxizität stark verringert6. Aus diesem Grund bieten Lichtbogenfluoreszenzmikroskope (LSFMs) effiziente Lösungen zur Untersuchung komplexer Prozesse auf mehreren biologisch relevanten Skalen und sind daher von besonderem Wert in der Entwicklungsbiologie, wo Proben bis zu mehreren Millimetern auf subzellulärer Ebene analysiert werden müssen.

In der Vergangenheit waren LSFMs stichprobenkammerbasiert7,8. In diesen Setups sind die Beleuchtungsachsen (x) und die Erkennungsachse (z) in der Regel senkrecht zur Gravitationsachse (y) angeordnet. Probenkammern bieten reichlich experimentelle Freiheit. Erstens bieten sie große bildgebende Pufferkapazitäten, was wiederum den Einsatz eines Perfusionssystems zur Kontrolle der Umwelt erleichtert, z. B. zur Aufrechterhaltung einer bestimmten Temperatur9 oder zur Anwendung biochemischer Stressoren. Darüber hinaus unterstützen sie kundenspezifische Montagemethoden10, die auf die jeweiligen experimentellen Bedürfnisse zugeschnitten sind, während die dreidimensionale, in einigen Fällen dynamische11-Integrität der Probe erhalten bleibt. Darüber hinaus sind Probenkammer-basierte Setups in der Regel mit einer Rotationsfunktion ausgestattet, die verwendet wird, um die Proben um die y-Achse zu drehen und sie so in zwei, vier oder sogar mehr Richtungen abzubilden. Da Embryonen von häufig verwendeten Modellorganismen im Kontext der Mikroskopie relativ große, aufeinander folgende Bildgebung entlang der ventral-dorsalen, lateralen und/oder vorderen-hinteren Körperachsen sind, bietet eine umfassendere Darstellung. Dies ermöglicht z.B. die langfristige Verfolgung von Zellen, die sich entlang komplexer dreidimensionaler Migrationspfadebewegen 12,13.

Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie wurde ausgiebig eingesetzt, um die embryonale Morphogenese von Drosophila melanogasterzu untersuchen, sowohl systematisch14,15 als auch mit einem spezifischen Fokus auf die biophysikalischen Aspekte der Entwicklung. Zum Beispiel wurde es verwendet, um hochauflösende morphogenetische Daten zu sammeln, um eine biomechanische Verbindung zwischen Endoderm-Invagination und Achsverlängerung während der Keimbanddehnung16 zu erkennen und den komplexen Zellfluss weiter mit Krafterzeugungsmustern während der Gastrulation17in Beziehung zu setzen. Es wurde auch mit anderen modernsten Techniken kombiniert, z.B. Optogenetik, um die Regulierung der Wnt-Signalisierung während der vorderen posterioren Musterung in der Epidermis18zu untersuchen.

Das Studium nur einer Art gibt jedoch keine Erkenntnisse über die Entwicklung der Entwicklung. Um die Embryogenese im phylogenetischen Kontext zu verstehen, wurde intensiv an alternativen Insektenmodellorganismen geforscht. Eine der am umfassendsten untersuchten Arten ist der Rotmehlkäfer Tribolium castaneum, ein wirtschaftlich relevanter gelagerter Getreideschädling19, dessen embryonale Morphogenese ebenfalls bereits systematisch mit LSFM20abgebildet wurde. Die embryonale Morphogenese dieser beiden Arten unterscheidet sich in mehreren Aspekten bemerkenswert, z.B. der Segmentierungsmodus21, sowie die Bildung und degradierung von extraembryonalen Membranen22. Letzterer Aspekt wurde bereits mit LSFMs ausgiebig analysiert. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass die Serosa, ein extraembryonales Gewebe, das den Tribolium-Embryo vor verschiedenen Gefahren für den großteil seiner Embryogenese23,24schützt und schützt, auch als morphogenetischer “Treiber” für seinen eigenen Entzugsprozess während des rückenförmigen Verschlusses25fungiert. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass während der Gastrulation ein bestimmter Bereich des Blastoderms an der Vitelline-Membran verankert bleibt, um asymmetrische Gewebebewegungen zu erzeugen26 und dass die regionalisierte Gewebefluidisierung es den Zellen ermöglicht, die Serosa-Kante während des Serosa-Fensterverschlusses sequenziell zu verlassen27.

In allen oben genannten Drosophila-und Tribolium-assoziiertenStudien wurden kammerbasierte LSFMs verwendet. In den meisten wurde die Embryos in mehreren Richtungen mit hilfe der Probenrotationsfunktion aufgezeichnet. Obwohl nicht ausdrücklich angegeben, kann davon ausgegangen werden, dass sie einzeln und damit unabhängig voneinander in sequenziellen Live-Imaging-Assays aufgezeichnet wurden, ähnlich wie unsere früheren Arbeiten an Tribolium20,28. In bestimmten Szenarien ist ein solcher Ansatz akzeptabel, aber insbesondere bei quantitativen Vergleichsansätzen kann die Umgebungsvarianz die Ergebnisse verzerren. Zum Beispiel ist es seit langem bekannt, dass die Entwicklungsgeschwindigkeit von Insekten temperaturabhängigist 29, aber eine neuere Studie legt weiter nahe, dass in Drosophila,Temperatur kann auch die Konzentration von Morphogenen beeinflussen30. Sollten daher bestimmte Merkmale der Embryogenese, z. B. die dynamischen Proportionen, Teilungsraten und Migrationsgeschwindigkeiten der Zellen, genau quantifiziert werden, sind ausreichende Wiederholungen ohne Umgebungsvarianz erforderlich. Dies minimiert Standardabweichungen und Standardfehler, was wiederum die Gegenüberstellung mit anderen, auch nur geringfügig divergierenden Versuchsbedingungen erleichtert.

Beispielkammerbasierte LSFMs sind jedoch in erster Linie für Tests mit hohem Gehalt und nicht für Tests mit hohem Durchsatz konzipiert. Im Gegensatz zu konfokalen Mikroskopen, die typischerweise mit standardisierten Klemmmechanismen für Mikroskopien, Petrischalen und Brunnenplatten ausgestattet sind, verwenden fast alle probenkammerbasierten LSFMs zylinderbasierte Klemmmechanismen. Diese Mechanismen sind für kundenspezifische Probenhalter gedacht, die rotationskompatibel sowie nicht-invasive10sind, aber in der Regel nicht für mehr als eine Probe20,31,32ausgelegt sind. Ein Rahmen für die gleichzeitige Live-Bildgebung von zwei oder mehr Embryonen, bei dem die Vorteile von probenkammerbasierten Setups nicht beeinträchtigt werden, befasst sich mit dem Problem der Umgebungsvarianz und erhöht so den Wert von LSFMs für vergleichende Studien.

In unserem Protokoll stellen wir einen experimentellen Rahmen für die vergleichende Live-Bildgebung in probenkammerbasierten LSFMs (Abbildung 1A) vor, in dem die y-Achse als Option zum “Stapeln” von Embryonen verwendet wird. Erstens bieten wir eine fluoreszierende mikrosphärenbasierte Kalibrierrichtlinie für Probenkammer-basierte LSFMs an, was besonders für Instrumente wichtig ist, die keinen Kalibrierassistenten haben. Zweitens beschreiben wir ein Montageverfahren für mehrere Embryonen auf der Grundlage des Spinnwebenhalters28 (Abbildung 1B), das mit der Probenrotation kompatibel ist und somit die gleichzeitige Abbildung mehrerer Proben entlang mehrerer Richtungen ermöglicht (Abbildung 1C). Mehrere Embryonen werden auf einem dünnen Agarosefilm ausgerichtet und nach dem Einsetzen in die Probenkammer sukzessive durch das Lichtblatt bewegt, um dreidimensionale Bilder zu erhalten. Drittens bieten wir drei beispielhafte Live-Imaging-Datensätze für Drosophila sowie für Triboliuman. Für erstere stellen wir transgene Linien fluoreszierend gekennzeichneten Kernen gegenüber. Für letztere vergleichen wir die Leistung transgener Sublinien, die dasselbe Transgen tragen, aber an verschiedenen genomischen Stellen. Schließlich diskutieren wir die Bedeutung der Parallelisierung im Hinblick auf die vergleichende Live-Bildgebung und Umgebungsvarianz33, diskutieren die Durchsatzgrenze unseres experimentellen Rahmens und bewerten die Anpassung unseres Ansatzes an andere Modellorganismen.

Protocol

1. Vorbereitende Arbeiten Wählen Sie für den LSFM eine Beleuchtungslinse/Erkennungslinse/Kamera-Kombination, die der wissenschaftlichen Frage gerecht wird, und richten Sie das Mikroskop ein. Die Größe des Sichtfeldes ist der Quotient der Kamerachipgröße und die Vergrößerung der Erkennungslinse. Die Beleuchtungslinse sollte so gewählt werden, dass das gesamte Sichtfeld durch ein grob planares Lichtblatt34abgedeckt wird. Drei empfohlene Kombinationen sind in Tabelle 1</str…

Representative Results

Unser Protokoll beschreibt einen experimentellen Rahmen für die vergleichende Fluoreszenz-Live-Bildgebung in Probenkammer-basierten LSFMs. Beispielsweise kann das Rahmenwerk verwendet werden, um (i) Embryonen von zwei oder mehr Arten, (ii) Embryonen von Linien, in denen ein oder mehrere Gene ausgeschlagen werden, plus Wildtypkontrollen, (iii) mehrere Embryonen derselben transgenen Linie, (iv) Embryonen aus verschiedenen transgenen Linien oder (v) Embryonen aus Unterlinien, die die gleiche Transgene tragen, gegenüberzus…

Discussion

Eines der exklusiven Anwendungsbereiche von LSFMs ist die Entwicklungsbiologie. In dieser Disziplin ist es wichtig, lebende Exemplare zu betrachten, da sonst morphogenetische Prozesse nicht dynamisch beschrieben werden können. Ein experimenteller Rahmen für die gleichzeitige Live-Bildgebung in Probenkammer-basierten LSFMs, wie hier beschrieben, ist aus zwei Hauptgründen praktisch.

Umgebungsvarianz, die in der sequentiellen Live-Bildgebung unvermeidbar ist, kann proaktiv angegangen werden. I…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Ernst H. K. Stelzer für die Gelegenheit, seine Ressourcen zu nutzen, sowie seine wertvollen Kommentare zum Manuskript, Anita Anderl für die Unterstützung mit dem Tribolium Live Imaging, Sven Plath für die technische Unterstützung sowie Ilan Davis, Nicole Grieder und Gerold Schubiger für die gemeinsame Nutzung ihrer transgenen Drosophila-Linien über das Bloomington Stock Center.

Materials

6-well plate Orange Scientific 4430500  
24-well plate Orange Scientific 4430300 Only for live imaging involving Tribolium
35-mm Ø Petri dish Fisher Scientific 153066 Only for live imaging involving Drosophila.
90-mm Ø Petri dish Fisher Scientific L9004575
100-µm mesh size cell strainer BD Biosciences 352360
250-µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-038 Only for live imaging involving Tribolium
300-µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-040 Only for live imaging involving Tribolium
710-µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-050 Only for live imaging involving Tribolium
800-µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-051 Only for live imaging involving Tribolium
405 fine wheat flour Demeter e.V. SP061006 Only for live imaging involving Tribolium
commercially available Drosophila medium Genesee Scientific 66-115 Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used
fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø Thermo Fisher Scientific T7282
inactive dry yeast Genesee Scientific 62-108 Only for live imaging involving Tribolium
low-melt agarose Carl Roth 6351.2
narrow vials Genesee Scientific 32-109 Only for live imaging involving Drosophila
small paint brush VWR International 149-2121
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl Carl Roth 9062.3 Caution: sodium hypochlorite is corrosive
whole wheat flour Demeter e.V. SP061036 Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour
wide vials Genesee Scientific 32-110 Only for live imaging involving Drosophila
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Ratke, J., Krämer, F., Strobl, F. Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes. J. Vis. Exp. (163), e61713, doi:10.3791/61713 (2020).
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