Imaging live simultaneo di più embrioni di insetti nei microscopi a fluorescenza a fogli di luce a camera campione
Summary
La microscopia a fluorescenza a fogli leggeri è lo strumento più prezioso nella biologia dello sviluppo. Uno dei principali problemi degli studi comparativi è la varianza ambientale. Il nostro protocollo descrive un framework sperimentale per l’imaging live simultaneo di più campioni e, pertanto, affronta questo problema in modo pro-attivo.
Abstract
La microscopia a fluorescenza a fogli leggeri offre soluzioni efficienti per studiare processi complessi su più scale biologicamente rilevanti. Le configurazioni basate su camera campione, che sono specificamente progettate per preservare l’integrità tridimensionale del campione e di solito presentano la rotazione del campione, sono la scelta migliore nella biologia dello sviluppo. Ad esempio, sono stati utilizzati per documentare l’intera morfogenesi embrionale della mosca della frutta Drosophila melanogaster e dello scarabeo di farina rossa Tribolium castaneum. Tuttavia, molti protocolli di imaging dal vivo disponibili forniscono solo framework sperimentali per singoli embrioni. Soprattutto per gli studi comparativi, tali approcci sono scomodi, poiché i campioni di immagine sequenziale sono influenzati dalla varianza ambientale. Inoltre, questo limita il numero di campioni che possono essere saggiati entro un dato tempo. Forniamo un framework sperimentale per l’imaging live simultaneo che aumenta la velocità effettiva nelle configurazioni basate su camera campione e quindi garantisce condizioni ambientali simili per tutti i campioni. In primo luogo, forniamo una linea guida di calibrazione per i microscopi a fluorescenza a fogli leggeri. In secondo luogo, proponiamo un metodo di montaggio per più embrioni compatibile con la rotazione del campione. In terzo luogo, forniamo set di dati tridimensionali esemplari di imaging vivo di Drosophila, per i quali giustappongiamo tre linee transgeniche con nuclei etichettati fluorescentmente, così come di Tribolium, per i quali confrontiamo le prestazioni di tre sottolinee transgeniche che trasportano la stessa transgenica, ma in diverse posizioni genomiche. Il nostro protocollo è specificamente progettato per studi comparativi in quanto affronta in modo pro-attivo la varianza ambientale, che è sempre presente nell’imaging dal vivo sequenziale. Ciò è particolarmente importante per le analisi quantitative e la caratterizzazione dei fenotipi aberrazione, che derivano ad esempio da esperimenti ad eliminazione diretta. Inoltre, aumenta la produttività complessiva, che è molto conveniente quando l’accesso ai microscopi a fluorescenza a fogli leggeri è limitato. Infine, il metodo di montaggio proposto può essere adattato ad altre specie di insetti e ad altri organismi modello, ad esempio il pesce zebra, senza praticamente alcuno sforzo di ottimizzazione.
Introduction
La microscopia a fluorescenza è una delle tecniche di imaging più essenziali nelle scienze della vita, specialmente nella biologia cellulare e dello sviluppo. Nei microscopi a fluorescenza confocale1, che sono all’avanguardia per l’imaging tridimensionale a fluorescenza dalla metà degli anni ’90, la stessa lente viene utilizzata per l’eccitazione del fluorofore e il rilevamento della luce di emissione. Il raggio laser di illuminazione eccita tutti i fluorofori lungo l’asse di illuminazione/rilevamento e il rispettivo segnale fuori fuoco viene discriminato prima del rilevamento da parte di un foro stenopeico. Quindi, per ogni immagine bidimensionale, l’intero campione è illuminato. Di conseguenza, per ogni immagine tridimensionale, cioè una pila di immagini bidimensionali spazialmente consecutive, l’intero campione viene illuminato da diverse decine a poche centinaia divolte 2,il che promuove il fotoblesciaching e la fototossicità3.
Quasi vent’anni fa, la tecnologia4 basata su fogli di luce emerse come una promettente alternativa per l’imaging tridimensionale a fluorescenza e divenne così un prezioso strumento nella biologia dello sviluppo5. In questo approccio, l’illuminazione e il rilevamento vengono disaccoppiati. L’obiettivo di illuminazione viene utilizzato per generare una scheda luminosa con una profondità di pochi micrometri all’interno del piano focale della lente di rilevamento disposta perpendicolarmente. Quindi, per ogni immagine bidimensionale, viene illuminato solo un sottile volume planare attorno al piano focale. Di conseguenza, per ogni immagine tridimensionale, l’intero campione viene illuminato una sola volta, il che diminuisce fortemente il fotobleaching e la fototossicità6. Per questo motivo, i microscopi a fluorescenza a fogli leggeri (LSFMs) offrono soluzioni efficienti per studiare processi complessi su più scale biologicamente rilevanti e sono, quindi, di particolare valore nella biologia dello sviluppo, dove campioni grandi fino a diversi millimetri devono essere analizzati a livello subcellulare.
Storicamente, gli LSFM sono stati campionati a camera7,8. In queste configurazioni, gli assi di illuminazione (x) e di rilevamento (z) sono solitamente disposti perpendicolarmente all’asse gravitazionale (y). Le camere campione offrono un’ampia libertà sperimentale. In primo luogo, forniscono grandi capacità tampone di imaging, il che a sua volta facilita l’uso di un sistema di perfusione per controllare l’ambiente, ad esempio per mantenere unatemperatura specifica 9 o per applicare stressanti biochimici. Inoltre, supportano metodi dimontaggio personalizzati 10 su misura per le rispettive esigenze sperimentali preservando l’integrità tridimensionale, in alcuni casidinamica 11,del campione. Inoltre, le configurazioni basate su camera campione sono solitamente dotate di una funzione di rotazione che viene utilizzata per ruotare i campioni attorno all’asse y e quindi immaginirli lungo due, quattro o anche più direzioni. Poiché gli embrioni di organismi modello comunemente usati sono, nel contesto della microscopia, immagini successive relativamente grandi lungo gli assi del corpo ventrale-dorsale, laterale e/o anteriore-posteriore forniscono una rappresentazione più completa. Ciò consente, ad esempio, il tracciamento a lungo termine delle celle che si muovono lungo complessi percorsi di migrazionetridimensionale 12,13.
La microscopia a fluorescenza a fogli leggeri è stata ampiamente applicata per studiare la morfogenesi embrionale della Drosophila melanogaster,siasistematicamente 14,15, sia con un focus specifico sugli aspetti biofisici dello sviluppo. Ad esempio, è stato utilizzato per raccogliere dati morfogenetici ad alta risoluzione al fine di rilevare un legame biomeccanico tra l’invaginazione dell’endoderma e l’estensione dell’asse durante l’allungamento della bandagerminale 16 e oltre per correlare il flusso cellulare complesso con i modelli di generazione della forza durante la gastrulazione17. È stato anche combinato con altre tecniche all’avanguardia, ad esempio l’optogenetica per indagare la regolazione della segnalazione Wnt durante la modelliatura anteriore-posteriore nell’epidermide18.
Tuttavia, studiare solo una specie non fornisce approfondimenti sull’evoluzione dello sviluppo. Per comprendere l’embriogenesi all’interno del contesto filogenetico, è stata condotta un’intensa ricerca con organismi alternativi del modello di insetto. Una delle specie più studiate è lo scarabeo di farina rossa Tribolium castaneum,un parassita di grano immagazzinatoeconomicamente rilevante 19, la cui morfogenesi embrionale è già stata sistematicamente immagine con LSFM20. La morfogenesi embrionale di queste due specie differisce notevolmente in diversi aspetti, ad esempio il modo di segmentazione21, così come la formazione e la degradazione delle membrane extra-embrionali22. Quest’ultimo aspetto è già stato ampiamente analizzato utilizzando LSFM. Ad esempio, è stato dimostrato che il serosa, un tessuto extra-embrionale che avvolge e protegge l’embrione del Tribolium da vari pericoli per la maggior parte della sua embriogenesi23,24, agisce anche come “driver” morfogenetico per il proprio processo di astinenza durante la chiusura dorsale25. Inoltre, è stato dimostrato che durante la gastrulazione, una particolare regione del blastoderma rimane ancorata alla membrana vitellina al fine di creare movimenti asimmetrici dei tessuti26 e, a seguito di questa osservazione, che la fluidizzazione dei tessuti regionalizzata consente alle cellule di lasciare sequenzialmente il bordo della serosa durante la chiusura della finestra di serosa27.
In tutti gli studi associati alla Drosophila– e al Triboliumsopra citati, sono stati utilizzati LSFM a camera campione. Nella maggior parte dei casi, gli embrioni sono stati registrati lungo più direzioni utilizzando la funzione di rotazione del campione. Sebbene non siano esplicitamente dichiarati, si può presumere che siano stati registrati individualmente e quindi indipendenti l’uno dall’altro in saggi sequenziali di imaging dal vivo, simili al nostro precedente lavoro su Tribolium20,28. In alcuni scenari, tale approccio è accettabile, ma soprattutto negli approcci comparativi quantitativi, la varianza ambientale può distorcere i risultati. Ad esempio, è noto da tempo che la velocità di sviluppo degli insetti dipende dalla temperatura29, ma uno studio più recente suggerisce inoltre che in Drosophila, la temperatura può anche influenzare la concentrazione di morfogeni30. Di conseguenza, se alcune caratteristiche dell’embriogenesi, ad esempio le proporzioni dinamiche, i tassi di divisione e le velocità di migrazione delle cellule, dovrebbero essere quantificate con precisione, sono necessarie ripetizioni sufficienti senza varianza ambientale. Ciò riduce al minimo le deviazioni standard e gli errori standard, che a loro volta facilitano la giustapposizione con altre condizioni sperimentali, anche solo marginalmente divergenti.
Tuttavia, gli LSFM a camera campione sono progettati principalmente per test ad alto contenuto piuttosto che ad alta produttività. A differenza dei microscopi confocali, che sono tipicamente dotati di meccanismi di bloccaggio standardizzati per vetrine per microscopia, piastre di Petri e piastre di pozzo, quasi tutti gli LSFM a camera campione utilizzano meccanismi di bloccaggio basati su cilindri. Questi meccanismi sono destinati a supporti campione su misura compatibili con la rotazione e non invasivi10,ma di solito non progettati per piùdi un campione 20,31,32. Un quadro per l’imaging live simultaneo di due o più embrioni, in cui i vantaggi delle configurazioni basate su camere campione non sono compromessi, affronta il problema della varianza ambientale aumentando così il valore degli LSFM per gli studi comparativi.
Nel nostro protocollo, presentiamo un quadro sperimentale per l’imaging dal vivo comparativo in LSFM a camera campione (Figura 1A) in cui l’asse y viene utilizzato come opzione per “impilare” gli embrioni. In primo luogo, forniamo una linea guida di calibrazione fluorescente basata sulla microsfera per gli LSFM a camera campione, che è particolarmente importante per gli strumenti che non dispongono di un assistente di calibrazione. In secondo luogo, descriviamo un metodo di montaggio per più embrioni basato sul titolare della ragnatela28 (Figura 1B) che è compatibile con la rotazione del campione e consente quindi l’imaging simultaneo di più campioni lungo più direzioni (Figura 1C). Diversi embrioni sono allineati sopra una sottile pellicola di agarosio e, dopo l’inserimento nella camera campione, si spostano successivamente attraverso la lastra luminosa per acquisire immagini tridimensionali. In terzo luogo, forniamo tre set di dati di imaging dal vivo esemplari per Drosophila e tribolium. Per il primo, giustapponemo linee transgeniche con nuclei etichettati fluorescentmente. Per quest’ultimo, confrontiamo le prestazioni delle sottolinee transgeniche che trasportano lo stesso transgene, ma in diverse posizioni genomiche. Infine, discutiamo dell’importanza della parallelizzazione per quanto riguarda l’imaging vivo comparativo e la varianza ambientale33,discutiamo il limite di produttività del nostro quadro sperimentale e valutiamo l’adattamento del nostro approccio ad altri organismi modello.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una delle aree di applicazione esclusive degli LSFM è la biologia dello sviluppo. In questa disciplina, è importante guardare gli esemplari viventi, altrimenti i processi morfogenetici non possono essere descritti in modo dinamico. Un quadro sperimentale per l’imaging live simultaneo negli LSFM a camera campione, come descritto qui, è conveniente per due motivi principali.
La varianza ambientale, che è inevitabile nell’imaging dal vivo sequenziale, può essere affrontata pro-attivamente. N…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Ernst H. K. Stelzer per l’opportunità di utilizzare le sue risorse e i suoi preziosi commenti sul manoscritto, Anita Anderl per il supporto con l’imaging dal vivo Tribolium, Sven Plath per il supporto tecnico, Nonché Ilan Davis, Nicole Grieder e Gerold Schubiger per aver condiviso le loro linee transgeniche Drosophila tramite il Bloomington Stock Center.
Materials
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100-µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | Only for live imaging involving Tribolium |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
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