サンプルチャンバーベースの光シート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング
Summary
光シートベースの蛍光顕微鏡は、発生生物学において最も価値のあるツールです。比較研究の大きな問題は、周囲分散です。我々のプロトコルは、複数の標本の同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを記述し、したがって、この問題に積極的に取り組む。
Abstract
ライトシートベースの蛍光顕微鏡は、複数の生物学的に関連するスケールで複雑なプロセスを研究するための効率的なソリューションを提供します。試料の三次元の完全性を維持するためにとりわけ設計され、通常サンプルの回転を特色にするサンプル室ベースのセットアップは、発生生物学の最良の選択である。例えば、それらは、ショ ウジョウバエメラノガスター および赤い小麦粉カブトムシ トリボリウムカスタネウムの果実フライの胚形態形成全体を文書化するために使用されてきた。しかし、利用可能なライブイメージングプロトコルの多くは、単一胚の実験的枠組みのみを提供します。特に比較研究では、このようなアプローチは、順次画像化された標本が周囲分散の影響を受けるため、不便である。さらに、これにより、所定の時間内にアッセイできる検体の数が制限されます。我々は、同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを提供し、サンプル室ベースのセットアップのスループットを向上させ、すべての標本に対して同様の周囲条件を保証します。まず、光シート蛍光顕微鏡の校正ガイドラインを提供します。第2に、試料回転に適合する複数の胚の実装方法を提案する。第三に、ショ ウジョウバエの典型的な3次元ライブイメージングデータセットを提供し、蛍光標識核と3つのトランスジェニックラインと Triboliumを並置し、同じ遺伝子を運ぶ3つのトランスジェニックサブラインの性能を比較しますが、ゲノムの異なる場所で比較します。私たちのプロトコルは、連続ライブイメージングで常に存在する周囲分散に積極的に対処するため、比較研究のために特別に設計されています。これは、ノックアウト実験などから生じる非収量性の型の定量的分析と特徴付けに特に重要です。また、全体的なスループットが向上し、蛍光顕微鏡の光シートへのアクセスが制限される場合に非常に便利である。最後に、提案された取り付け方法は、他の昆虫種およびさらなるモデル生物、例えばゼブラフィッシュに対して、基本的に最適化努力を伴わない適応することができる。
Introduction
蛍光顕微鏡は、生命科学、特に細胞生物学および発生生物学において最も重要なイメージング技術の1つです。共焦点蛍光顕微鏡1では、1990年代半ば以降の3次元蛍光イメージングの最先端のものであり、同じレンズが蛍光色素励起および発光光検出に使用されている。照明レーザービームは、照明/検出軸に沿ってすべての蛍光を励起し、それぞれの焦点外信号はピンホールによって検出される前に識別されます。したがって、各2次元画像について、全体の標本が照らされます。その結果、各3次元画像、すなわち、空間的に連続した2次元画像の積層に対して、検体全体が数十〜数百倍2回照らされ、光漂白および光毒性を促進する3。
約20年前、光シートベースの技術4 は、3次元蛍光イメージングの有望な代替手段として登場し、発生生物学5において貴重なツールとなりました。このアプローチでは、照明と検出が分離されます。照明レンズは、垂直に配置された検出レンズの焦点面内に数マイクロメートルの深さの光シートを生成するために使用される。したがって、2 次元イメージごとに、焦点面の周りの薄い平面ボリュームのみが照らされます。その結果、各3次元画像について、検体全体が一度だけ照射され、光漂白と光毒性6が強く減少する。このため、光シート蛍光顕微鏡(LSFMs)は、複数の生物学的に関連するスケールで複雑なプロセスを研究するための効率的なソリューションを提供し、特に数ミリメートルの大きさの標本を細胞内レベルで分析する必要がある発生生物学において価値があります。
歴史的に、LSCMはサンプルチャンバーベース7、8であった。これらの設定では、照明(x)および検出(z)軸は、通常、重力軸(y)に垂直に配置されます。サンプルチャンバーは、十分な実験の自由を提供します。第一に、それらは、特定の温度9を維持したり、生化学的ストレッサーを適用するために、環境を制御するために灌流システムの使用を容易にする、大きなイメージングバッファ容量を提供します。また、それらは、三次元を維持しながらそれぞれの実験ニーズに合わせたカスタマイズされた取付方法10を支持し、場合によっては、試料の完全性を動的にする。さらに、サンプルチャンバベースのセットアップは、通常、y軸の周りに標本を回転させ、2つ、4つ以上の方向に沿ってそれらをイメージするために使用される回転関数が装備されています。一般的に使用されるモデル生物の胚は、顕微鏡の文脈では、腹側側側、横方向、および/または前後部体軸に沿って比較的大きく、連続したイメージングがより包括的な表現を提供するからである。これにより、例えば、複雑な3次元移行経路12、13に沿って移動する細胞の長期追跡が可能になります。
軽シート系蛍光顕微鏡は、ショウジョウバエメラノガスターの胚形態形成を研究するために広範囲に適用されており、いずれも体系的に14、15、ならびに開発の生物物理学的側面に特に焦点を当てています。例えば、胚芽伸長16中の内胚葉内挿と軸延長との間の生体力学的リンクを検出するために高解像度のモルモジェネティックデータを収集し、さらに、胃の間の力発生パターンと複雑な細胞流を関連付けるために使用した。また、他の最先端技術、例えば、表皮18における前後部パターニング中のWntシグナル伝達の調節を調査する光遺伝学も組み合わされている。
しかし、1つの種だけを研究することは、発達の進化に関する洞察を提供するものではありません。系統的な文脈における胚発生を理解するために、代替昆虫モデル生物を用いて集中的な研究が行われている。最も包括的に調査された種の1つは、経済的に関連する貯蔵穀物害虫19である赤い小麦粉カブトムシトボリウムカスタネウムであり、その胚形態形成もすでにLSFM20で体系的に画像化されている。これら2種の胚形態形成は、いくつかの局面において著しく異なり、例えば、セグメンテーションモード21、ならびに胚外膜22の形成および分解が挙げられる。後者の側面は、LSFMを使用してすでに広範囲に分析されています。例えば、胚発生の良い部分に対する様々な危険からトリボリウム胚を包み込み、保護する胚外組織であるセロサは、背側閉鎖25の間に独自の撤退プロセスのための形態遺伝学的「ドライバー」としても作用することが示されている。また、気中中、ブラストドアルムの特定の領域が、非対称組織運動26を作成するためにビテリン膜に固定されたままであり、この観察に続いて、細胞がセロサ窓閉閉中に細胞を順次残すことを可能にすることが実証されている。
上記に引用したすべてのショウジョウバエとトリボリウム関連研究では、サンプルチャンバーベースのLSFMが使用されている。ほとんどの場合、胚はサンプル回転関数を使用して複数の方向に沿って記録された。明示的には述べられていないが、Tribolium20,28に関する我々の以前の研究と同様に、逐次ライブイメージングアッセイにおいて個別に独立して記録されていると仮定することができる。特定のシナリオでは、このようなアプローチは許容されますが、特に定量的比較アプローチでは、周囲分散が結果を歪める可能性があります。例えば、昆虫の発生速度は温度依存性29であると長い間知られているが、さらに最近の研究では、ショウジョウバエでは、温度がモルフォゲン30の濃度にも影響を与える可能性があることを示唆している。その結果、胚発生の特定の特性、例えば、細胞の動的な割合、分割速度および移動速度を、正確に定量化する必要がある場合、周囲分散を伴わない十分な反復が必要となる。これにより標準偏差と標準偏差誤差が最小限に抑え、わずかに発散した実験条件であっても他の条件との並置が容易になります。
しかし、サンプルチャンバーベースのLSFMは、主に高スループットアッセイではなく、高い含有量のために設計されています。顕微鏡スライド、ペトリ皿、ウェルプレート用の標準化クランプ機構が一般的に装備されている共焦点顕微鏡とは異なり、ほぼすべてのサンプルチャンバーベースのLSFMはシリンダーベースのクランプ機構を使用します。これらのメカニズムは、回転互換性があるカスタムメイドのサンプルホルダーと非侵襲的な10を対象としていますが、通常は20、31、32以上の標本用に設計されていません。サンプルチャンバーベースのセットアップの利点が損なわれない2つ以上の胚の同時ライブイメージングのフレームワークは、周囲分散の問題に対処し、それによって比較研究のためのLSFMsの価値を高める。
我々のプロトコルでは、y軸が胚を「積み重ねる」オプションとして使用されるサンプルチャンバーベースのLSFM(図1A)における比較ライブイメージングの実験的枠組みを提示する。まず、サンプルチャンバーベースのLSFMsに蛍光マイクロスフィアベースのキャリブレーションガイドラインを提供します。第二に、試料の回転に対応し、複数の方向に沿って複数の標本を同時に撮像できるクモの巣ホルダー28(図1B)に基づく複数の胚の取り付け方法を説明する(図1C)。いくつかの胚は、薄いアガロースフィルムの上に整列し、サンプルチャンバーに挿入した後、三次元画像を取得するためにライトシートを連続的に移動した。第三に、ショウジョウバエとトリボリウムのための3つの模範的なライブイメージングデータセットを提供します。前者については、トランスジェニックラインを蛍光標識核と並置する。後者の場合、同じ遺伝子導入を運ぶトランスジェニックサブラインのパフォーマンスを比較しますが、ゲノムの異なる場所で行います。最後に、比較ライブイメージングと周囲分散33に関する並列化の重要性について議論し、実験フレームワークのスループット限界を議論し、他のモデル生物へのアプローチの適応を評価する。
Protocol
Representative Results
Discussion
LSFの排他的な応用分野の1つは、発生生物学です。この分野では、生きた標本を見ることは重要であり、そうでなければ形態形成プロセスは動的に記述することはできません。ここで説明するサンプルチャンバベースのLSFMにおける同時ライブイメージングの実験的フレームワークは、2つの大きな理由から便利である。
連続ライブイメージングでは避けられない周囲分散?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
エルンスト・H・K・ステルツァーは、彼のリソースだけでなく、原稿に関する彼の貴重なコメントを使用する機会に感謝します, トリボリウム ライブイメージングのためのサポートのためのアニタ・アンデルル, 技術サポートのためのスヴェン・プラスだけでなく、イラン・デイビス, ニコール・グリーダーとジェロルド・シュービガーは、ブルーミントンストックセンターを介して彼らの遺伝子導入 ショウジョフィラ ラインを共有しました.
Materials
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100-µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | Only for live imaging involving Tribolium |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
References
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), 2-5 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003 (2017).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
- Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
- Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
- Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
- Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292 (2015).
- Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454 (2018).
- Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636 (2017).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
- El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
- Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
- Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082 (2013).
- Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111 (2014).
- Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834 (2016).
- Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
- Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193 (2019).
- Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629 (2017).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
- Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
- Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
- Mcdonald, J. H. . Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , (2013).
- Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677 (2018).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
- Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240 (2017).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
- Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
- Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
- He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065 (2019).
- Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
- Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , (1997).
- Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
- Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555 (2014).
- McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
- Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
- Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
- Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
- Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616 (2018).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
- Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194 (2018).
