샘플 챔버 기반 광시트 형광 현미경에서 여러 곤충 배아의 동시 라이브 이미징
Summary
광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.
Abstract
광 시트 기반 형광 현미경 검사는 여러 생물학적 관련 저울에서 복잡한 프로세스를 연구하는 효율적인 솔루션을 제공합니다. 시편의 3차원 무결성을 보존하도록 특별히 설계된 샘플 챔버 기반 설정은 일반적으로 샘플 회전을 특징으로 하며, 발달 생물학에서 최선의 선택입니다. 예를 들어, 그들은 과일 플라이 Drosophila 멜라노가스터와 붉은 밀가루 딱정벌레 트리볼륨 카스타뉴움의전체 배아 형태 발생을 문서화하는 데 사용되었습니다. 그러나, 유효한 많은 살아있는 화상 진찰 프로토콜은 단 하나 태아를 위한 단지 실험적인 프레임 워크를 제공합니다. 특히 비교 연구를 위해 순차적으로 이미지된 표본이 주변 분산의 영향을 받고 있기 때문에 이러한 접근 방식이 불편합니다. 또한, 이것은 주어진 시간 내에 분석될 수 있는 표본의 수를 제한한다. 당사는 샘플 챔버 기반 설정의 처리량을 증가시키고 따라서 모든 표본에 대해 유사한 주변 조건을 보장하는 동시 라이브 이미징을 위한 실험 프레임워크를 제공합니다. 첫째, 우리는 광 시트 형광 현미경에 대한 교정 지침을 제공합니다. 둘째, 샘플 회전과 호환되는 다중 배아에 대한 장착 방법을 제안합니다. 셋째, Drosophila의예시적인 3차원 라이브 이미징 데이터 세트를 제공하며, 3개의 형질표시 핵과 트리볼륨을병치하여 동일한 트랜스유전자를 운반하는 3개의 트랜스제닉 서브라인의 성능을 비교하지만 다른 게놈 위치에서 제공합니다. 우리의 프로토콜은 항상 순차적인 라이브 이미징에 항상 존재하는 주변 분산을 적극적으로 해결하므로 비교 연구를 위해 특별히 설계되었습니다. 이는 녹아웃 실험과 같은 비정상적인 표현형의 정량적 분석 및 특성화에 특히 중요합니다. 또한, 전체 처리량을 증가시킵니다, 이는 광시트 형광 현미경에 접근할 때 매우 편리하며, 이는 제한적이다. 마지막으로, 제안된 장착 방법은 기본적으로 최적화 노력이 없는 다른 곤충 종 및 추가 모델 유기체(예: 제브라피시)에 적응할 수 있다.
Introduction
형광 현미경 검사는 특히 세포 및 발달 생물학에서 생명 과학에서 가장 필수적인 이미징 기술 중 하나입니다. 1990년대 중반부터 3차원 형광 영상에 대한 최첨단 형광 현미경1에서동일한 렌즈가 형광 발암 및 방출 광 검출에 사용된다. 조명 레이저 빔은 조명/검출 축을 따라 모든 형광을 자극하고 핀홀에 의해 검출되기 전에 각각의 초점이 벗어난 신호가 차별된다. 따라서 각 2차원 이미지에 대해 전체 표본이 조명됩니다. 따라서, 각 3차원 이미지, 즉 공간적으로 연속적인 2차원 이미지의 스택에 대해, 전체 표본은 12~수백배2의조명을 통해 광표백 및광독성3를촉진한다.
거의 20년 전, 광시트 기반 기술4는 3차원 형광 이미징을 위한 유망한 대안으로 등장하여 발달 생물학5에서귀중한 도구가 되었습니다. 이 접근 방식에서는 조명 및 감지가 분리됩니다. 조명 렌즈는 수직으로 배열된 검출 렌즈의 초점 평면 내에서 몇 마이크로미터의 깊이만 있는 라이트 시트를 생성하는 데 사용됩니다. 따라서 각 2차원 이미지에 대해 초점 평면 주위의 얇은 평면 부피만 조명됩니다. 따라서, 각 입체 이미지에 대해, 전체 표본은 한 번만 조명되어 광표백 및 광독성6을강하게 감소시다. 이러한 이유로, 광 시트 형광 현미경 (LSFM)은 여러 생물학적으로 관련된 비늘에 복잡한 프로세스를 연구하는 효율적인 솔루션을 제공하므로, 따라서, 개발 생물학에서 특히 가치, 여기서 몇 밀리미터만큼 큰 표본은 세포 극이하 수준에서 분석되어야.
역사적으로 LSFM은 챔버 기반7,8을샘플링했습니다. 이러한 설정에서 조명(x) 및 검출(z) 축은 일반적으로 중력 축(y)에 수직으로 배열됩니다. 샘플 챔버는 충분한 실험적 자유를 제공합니다. 첫째, 그들은 차례로 환경을 제어하기 위해 관류 시스템의 사용을 용이하게 큰 이미징 버퍼 용량을 제공합니다, 예를 들어, 특정온도를 유지하거나 생화학 적 스트레스를 적용. 또한, 시편의 동적 11, 무결성을 유지하면서 각각의 실험 요구에 맞는 맞춤형 장착방법(10)을 지원합니다. 또한, 샘플 챔버 기반 설정은 일반적으로 y 축 을 중심으로 표본을 회전시키고 따라서 2, 4 또는 더 많은 방향을 따라 이미지를 그리는 데 사용되는 회전 기능이 장착되어 있습니다. 일반적으로 사용되는 모델 유기체의 배아는 현미경 검사법의 맥락에서, 상대적으로 크고 연속적인 화상 진찰이 복부-등주, 측면 및/또는 전방 후방 바디 축을 보다 포괄적인 표현을 제공한다. 이를 통해 예를 들어, 복잡한 3차원 마이그레이션 경로를 따라 이동하는 셀의 장기추적(12,13)을허용한다.
광시트 계형현미경검사는 드로소필라 멜라노가스터의배아 형태발생을 연구하기 위해 광범위하게 적용되었으며, 둘 다 체계적으로14,15뿐만 아니라 발달의 생물물리학적 측면에 대한 구체적인 초점을 맞추고 있다. 예를 들어, 고분해능 형태유전학 데이터를 수집하여 생식기연신기(16)의 내막질 질 및 축 확장 사이의 생체 기계적 연관성을 검출하고,가스화(17)동안 힘 발생 패턴과 복잡한 세포 흐름을 더욱 연관시키는 데 사용되었다. 또한 다른 최첨단 기술, 예를 들어, 표피18에서전방 후방 패터닝 중 Wnt 신호의 조절을 조사하기 위해 광유전학과 결합되었다.
그러나, 단 하나의 종을 공부하는 것은 개발의 진화에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다. 계통 유전학 적 맥락 내에서 배아 발생을 이해하기 위해, 집중적 인 연구는 대체 곤충 모델 유기체와 함께 실시되었습니다. 가장 포괄적으로 조사된 종 중 하나는 적색 밀가루 딱정벌레 트리볼륨 카스타늄(Tribolium castaneum)으로,경제적으로 관련된 저장된 곡물해충(19)이며,배아 형태발생또한 이미 LSFM20으로체계적으로 이미지화되었다. 이 두 종의 배아 형태발생은 여러 양상에서 현저하게 다르다, 예를 들어, 세분화모드(21)뿐만아니라 엑스트라 배아막(22)의형성 및 분해. 후자의 측면은 이미 LSFM을 사용하여 광범위하게 분석되었습니다. 예를 들어, 그 배아 발생23,24의더 나은 부분에 대한 다양한 위험으로부터 트리볼륨 배아를 포위하고 보호하는 엑스트라 배아 조직인 세로사는 등쪽 폐쇄25시 자체 철수 과정을 위한 형태유전학적 “운전자”로 작용하는 것으로 나타났다. 또한, 위트포송 시, 블라스트로드름의 특정 부위가 비대칭 조직 운동을 만들기 위해 비텔린 막에 고정되어있으며, 이러한 관찰에 따라 지역화된 조직 유동화를 통해 세포가 세로사 창폐쇄(27)동안 세포가 순차적으로 세로사 가장자리를 떠날 수 있다는 것이 입증되었다.
모든 드로소필라에서– 그리고 Tribolium-연관된 연구 위에서 인용, 견본 챔버 기지를 둔 LSFM가 이용되었습니다. 대부분의 경우, 배아는 샘플 회전 기능을 사용하여 여러 방향을 따라 기록되었다. 명시적으로 명시되지는 않지만, 트리볼륨20,28에대한 이전 작업과 유사한 순차적인 라이브 이미징 소에서 개별적으로 서로 독립적으로 기록되었다고 가정할 수 있습니다. 특정 시나리오에서는 이러한 접근 방식이 허용되지만 특히 양적 비교 접근 방식에서는 주변 분산이 결과를 왜곡할 수 있습니다. 예를 들어, 곤충의 발달 속도가 온도의존29라는것은 오랫동안 알려져 왔지만, 최근 연구에 따르면 드로소필라에서는온도가 모르포겐(30)의 농도에도 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 따라서, 배아 발생의 특정 특성, 예를 들어, 세포의 동적 비율, 분할 비율 및 이주 속도, 정확하게 정량화되어야하며, 주변 분산이 없는 충분한 반복이 필요하다. 이렇게 하면 표준 편차 및 표준 오류를 최소화하므로 다른 실험 조건과 병치가 용이합니다.
그러나 샘플 챔버 기반 LSFM은 주로 높은 처리량 애서가 아닌 높은 함량을 위해 설계되었습니다. 일반적으로 현미경 슬라이드, 페트리 접시 및 웰 플레이트에 대한 표준화된 클램프 메커니즘이 장착된 공초점 현미경과 달리 거의 모든 샘플 챔버 기반 LSFM은 실린더 기반 클램프 메커니즘을 사용합니다. 이러한 메커니즘은 회전 호환뿐만 아니라 비침습적10인맞춤형 샘플 홀더를 위한 것이지만 일반적으로 둘 이상의 표본20,31,32를위해 설계되지 는 않습니다. 샘플 챔버 기반 설정의 장점이 손상되지 않는 두 개 이상의 배아의 동시 라이브 이미징을 위한 프레임워크는 주변 분산 문제를 해결하여 비교 연구를 위한 LSFMs의 가치를 증가시합니다.
우리의 프로토콜에서, 우리는 y 축이 배아를 “스택”하는 옵션으로 사용되는 샘플 챔버 기반 LSFM(도 1A)에서비교 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 제시한다. 첫째, 우리는 교정 도우미가 부족한 기기에 특히 중요한 샘플 챔버 기반 LSFM에 대한 형광 마이크로스피어 기반 교정 지침을 제공합니다. 둘째, 시료 회전과 호환되는 거미줄홀더(28)(도 1B)를기반으로 다중 배아에 대한 장착 방법을 설명하고 따라서 다중 방향을 따라 다중 시편의 동시 이미징을 허용한다(도1C). 몇몇 배아는 얇은 아가로즈 필름 위에 정렬되고, 샘플 챔버에 삽입 한 후, 3 차원 이미지를 얻기 위해 라이트 시트를 통해 연속적으로 이동. 셋째, 드로소필라와 트리볼륨에대한 세 가지 모범적인 라이브 이미징 데이터 세트를 제공합니다. 전자의 경우 형광으로 표지된 핵을 가진 형질전환선을 병치합니다. 후자의 경우 동일한 트랜스진을 운반하는 트랜스제닉 하위 라인의 성능을 비교하지만 다른 게놈 위치에서 비교합니다. 마지막으로, 비교 라이브 이미징 및 주변분산(33)과관련하여 병렬화의 중요성에 대해 논의하고, 실험 프레임워크의 처리량 한계에 대해 논의하고 다른 모델 유기체에 대한 접근 방식의 적응을 평가합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
LSFM의 독점적 인 응용 분야 중 하나는 발달 생물학입니다. 이 분야에서, 살아있는 표본을 보는 것이 중요합니다, 그렇지 않으면 형태 유전학 과정은 동적 방식으로 설명 될 수 없다. 여기에 설명된 바와 같이 샘플 챔버 기반 LSFM에서 동시 라이브 이미징을 위한 실험 프레임워크는 두 가지 주요 이유로 편리합니다.
순차적인 라이브 이미징에서 피할 수 없는 주변 분산은 적극적?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 자신의 자원을 사용할 수있는 기회뿐만 아니라 원고에 대한 자신의 귀중한 의견뿐만 아니라, 트리볼륨 라이브 이미징, 기술 지원을위한 스벤 플래스뿐만 아니라 일란 데이비스, 니콜 Grieder와 게롤드 슈비거블루밍 스톡 센터를 통해 자신의 형질전환 Drosophila 라인을 공유에 대한 자신의 자원을 사용할 수있는 기회에 감사드립니다.
Materials
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100-µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | Only for live imaging involving Tribolium |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
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