Imagens ao vivo simultâneas de embriões múltiplos de insetos em microscópios de fluorescência baseados em folha de luz da amostra

Summary

A microscopia de fluorescência à base de folha de luz é a ferramenta mais valiosa na biologia do desenvolvimento. Um grande problema em estudos comparativos é a variância ambiente. Nosso protocolo descreve uma estrutura experimental para imagens ao vivo simultâneas de múltiplos espécimes e, portanto, aborda essa questão de forma pró-ativa.

Abstract

A microscopia de fluorescência baseada em folha de luz oferece soluções eficientes para estudar processos complexos em múltiplas escalas biologicamente relevantes. As configurações baseadas em câmaras de amostra, que são especificamente projetadas para preservar a integridade tridimensional do espécime e geralmente apresentam rotação de amostras, são a melhor escolha em biologia do desenvolvimento. Por exemplo, eles têm sido usados para documentar toda a morfogênese embrionária da mosca-das-frutas Drosophila melanogaster e do besouro de farinha vermelha Tribolium castaneum. No entanto, muitos protocolos de imagem ao vivo disponíveis fornecem apenas estruturas experimentais para embriões únicos. Especialmente para estudos comparativos, tais abordagens são inconvenientes, uma vez que espécimes sequencialmente imagens são afetados pela variância ambiente. Além disso, limita o número de espécimes que podem ser testados dentro de um determinado tempo. Fornecemos uma estrutura experimental para imagens ao vivo simultâneas que aumenta o throughput em configurações baseadas em câmaras de amostra e, portanto, garante condições ambientais semelhantes para todos os espécimes. Em primeiro lugar, fornecemos uma diretriz de calibração para microscópios de fluorescência de folha de luz. Em segundo lugar, propomos um método de montagem para múltiplos embriões compatível com a rotação de amostras. Em terceiro lugar, fornecemos conjuntos de dados de imagem ao vivo tridimensionais exemplares de Drosophila, para os quais justapõem três linhas transgênicas com núcleos fluorescentes rotulados, bem como de Tribolium,para os quais comparamos o desempenho de três sublines transgênicas que carregam o mesmo transgênico, mas em diferentes locais genômicos. Nosso protocolo é especificamente projetado para estudos comparativos, pois aborda proativamente a variância ambiente, que está sempre presente em imagens vivas sequenciais. Isso é especialmente importante para análises quantitativas e caracterização de fenótipos aberrationais, que resultam, por exemplo, de experimentos eliminatórios. Além disso, aumenta o throughput global, que é altamente conveniente quando o acesso a microscópios de fluorescência de folha de luz é limitado. Finalmente, o método de montagem proposto pode ser adaptado para outras espécies de insetos e outros organismos modelo, por exemplo, zebrafish, sem basicamente nenhum esforço de otimização.

Introduction

A microscopia de fluorescência é uma das técnicas de imagem mais essenciais nas ciências da vida, especialmente na biologia celular e de desenvolvimento. Nos microscópios de fluorescência confocal¹, que são de última geração para imagens de fluorescência tridimensional desde meados da década de 1990, a mesma lente é usada para excitação fluorófora e detecção de luz de emissões. O raio laser de iluminação excita todos os fluoroforos ao longo do eixo de iluminação/detecção e o respectivo sinal fora de foco é discriminado antes da detecção por um orifício. Assim, para cada imagem bidimensional, todo o espécime é iluminado. Consequentemente, para cada imagem tridimensional, ou seja, uma pilha de imagens tridimensionais espacialmente consecutivas, todo o espécime é iluminado várias dezenas a algumas centenas^{de vezes 2}, o que promove fotobleaching e fototoxicidade³.

Há quase vinte anos, a tecnologia⁴ surgiu como uma alternativa promissora para a imagem de fluorescência tridimensional e, assim, tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia do desenvolvimento⁵. Nesta abordagem, a iluminação e a detecção são dissociadas. A lente de iluminação é usada para gerar uma folha de luz com uma profundidade de apenas alguns micrômetros dentro do plano focal da lente de detecção perpendicularmente organizada. Assim, para cada imagem bidimensional, apenas um fino volume planar ao redor do plano focal é iluminado. Consequentemente, para cada imagem tridimensional, todo o espécime é iluminado apenas uma vez, o que diminui fortemente o fotobleaching e a fototoxicidade⁶. Por essa razão, os microscópios de fluorescência de folhas de luz (LSFMs) oferecem soluções eficientes para estudar processos complexos em múltiplas escalas biologicamente relevantes e são, portanto, de valor particular na biologia do desenvolvimento, onde espécimes tão grandes quanto vários milímetros devem ser analisados no nível subcelular.

Historicamente, os LSFMs têm sido baseados em câmara de amostra^7,8. Nestas configurações, os eixos de iluminação (x) e detecção (z) são geralmente organizados perpendicularmente ao eixo de gravidade (y). As câmaras de amostra oferecem ampla liberdade experimental. Em primeiro lugar, eles fornecem grandes capacidades de tampão de imagem, o que, por sua vez, facilita o uso de um sistema de perfusão para controlar o ambiente, por exemplo, para manter uma temperatura específica⁹ ou para aplicar estressores bioquímicos. Além disso, eles suportam métodos de montagem personalizados¹⁰ que são adaptados às respectivas necessidades experimentais, preservando o tridimensional, em alguns casos dinâmico¹¹, integridade do espécime. Além disso, as configurações baseadas em câmaras de amostra são geralmente equipadas com uma função de rotação que é usada para girar os espécimes ao redor do eixo y e, assim, imagen-los ao longo de duas, quatro ou até mais direções. Uma vez que os embriões de organismos modelos comumente usados são, no contexto da microscopia, imagens relativamente grandes e sucessivas ao longo dos eixos ventral-dorsal, lateral e/ou anterior-posterior do corpo fornecem uma representação mais abrangente. Isso permite, por exemplo, o rastreamento a longo prazo de células que se movem ao longo de complexas rotas de migração tridimensional^12,13.

A microscopia de fluorescência à base de folha de luz tem sido aplicada extensivamente para estudar a morfogênese embrionária de Drosophila melanogaster, ambos sistematicamente^14,15, bem como com foco específico nos aspectos biofísicos do desenvolvimento. Por exemplo, foi usado para coletar dados morfogenéticos de alta resolução, a fim de detectar uma ligação biomecânica entre a invaginação do endoderme e a extensão do eixo durante o alongamento da banda germinal¹⁶ e ainda para relacionar o complexo fluxo celular com padrões de geração de força durante a gastrulação¹⁷. Também foi combinado com outras técnicas de última geração, por exemplo, optogenética para investigar a regulação da sinalização Wnt durante a padronização anterior-posterior na epiderme¹⁸.

No entanto, estudar apenas uma espécie não fornece insights sobre a evolução do desenvolvimento. Para entender a embriogênese dentro do contexto filogenético, pesquisas intensivas têm sido realizadas com organismos alternativos de modelos de insetos. Uma das espécies mais bem investigadas é o besouro de farinha vermelha Tribolium castaneum, uma praga de grãos armazenados economicamente relevante^19,cuja morfogênese embrionária também já foi sistematicamente imageada com LSFM²⁰. A morfogênese embrionária dessas duas espécies difere notavelmente em vários aspectos, por exemplo, no modo de segmentação^21,bem como na formação e degradação das membranas extraembrionárias²². Este último aspecto já foi extensivamente analisado utilizando LSFMs. Por exemplo, foi demonstrado que o serosa, um tecido extraembrionário que envolve e protege o embrião do Tribípio de vários perigos para a maior parte de sua embriogênese^23,24, também atua como o “driver” morfogenético para seu próprio processo de retirada durante o fechamento dorsal²⁵. Além disso, foi demonstrado que durante a gastruação, uma determinada região do blastoderm permanece ancorada na membrana vitelline, a fim de criar movimentos assimétricos do tecido²⁶ e, após essa observação, que a fluidização de tecido regionalizado permite que as células deixem sequencialmente a borda serosa durante o fechamento da janela^{serosa 27}.

Em todos os estudos associados à Drosophila– e triboliumcitados acima, foram utilizados LSFMs baseados em câmaras de amostra. Na maioria, os embriões foram registrados ao longo de várias direções usando a função de rotação da amostra. Embora não declarado explicitamente, pode-se supor que eles foram registrados individualmente e, portanto, independentes uns dos outros em ensaios de imagem ao vivo sequencial, semelhante ao nosso trabalho anterior em Tribolium^20,28. Em certos cenários, tal abordagem é aceitável, mas especialmente em abordagens quantitativas comparativas, a variância ambiente pode distorcer os resultados. Por exemplo, sabe-se há muito tempo que a velocidade de desenvolvimento dos insetos é dependente da temperatura^29,mas um estudo mais recente sugere ainda que em Drosophila, a temperatura também pode afetar a concentração de morfogênicos³⁰. Consequentemente, se certas características da embriogênese, por exemplo, as proporções dinâmicas, as taxas de divisão e as velocidades de migração das células, devem ser precisamente quantificadas, são necessárias repetições suficientes sem variância ambiente. Isso minimiza desvios padrão e erros padrão, o que, por sua vez, facilita a justaposição com outras condições experimentais, mesmo que marginalmente divergentes.

No entanto, os LSFMs baseados em câmara de amostra são projetados principalmente para alto conteúdo em vez de ensaios de alto rendimento. Ao contrário dos microscópios confocal, que são tipicamente equipados com mecanismos padronizados de grampo para lâminas de microscopia, placas de Petri e placas de poço, quase todos os LSFMs baseados em câmara de amostra usam mecanismos de grampo baseados em cilindros. Estes mecanismos destinam-se a suportes de amostra personalizados compatíveis com a rotação, bem como não invasivos^10,mas geralmente não projetados para mais de uma amostra^20,31,32. Uma estrutura para imagens ao vivo simultâneas de dois ou mais embriões, em que as vantagens das configurações baseadas em câmaras de amostra não são comprometidas, aborda a questão da variância ambiente, aumentando assim o valor dos LSFMs para estudos comparativos.

Em nosso protocolo, apresentamos uma estrutura experimental para imagens ao vivo comparativas em LSFMs baseados em câmara de amostra (Figura 1A) em que o eixo y é usado como opção para “empilhar” embriões. Em primeiro lugar, fornecemos uma diretriz de calibração baseada em microesfera fluorescente para LSFMs baseados em câmara de amostra, o que é especialmente importante para instrumentos que não possuem um assistente de calibração. Em segundo lugar, descrevemos um método de montagem para múltiplos embriões baseado no suporte da teia de aranha²⁸ (Figura 1B) que é compatível com a rotação da amostra e, portanto, permite imagens simultâneas de múltiplas amostras ao longo de múltiplas direções(Figura 1C). Vários embriões são alinhados em cima de um filme fino de ágarose e, após a inserção na câmara de amostra, moveram-se sucessivamente através da folha de luz para adquirir imagens tridimensionais. Em terceiro lugar, fornecemos três conjuntos de dados de imagem ao vivo exemplares para Drosophila, bem como para Tribolium. Para o primeiro, justapomos linhas transgênicas com núcleos fluorescentes rotulados. Para este último, comparamos o desempenho de sublines transgênicas que carregam o mesmo transgênico, mas em diferentes locais genômicos. Por fim, discutimos a importância da paraleloização no que diz respeito à imagem ao vivo comparativa e à variância ambiente^33,debatemos o limite de rendimento de nosso quadro experimental e avaliamos a adaptação de nossa abordagem a outros organismos modelo.

Protocol

1. Trabalho preparatório Escolha uma combinação de lente/lente de detecção/câmera de iluminação para o LSFM que se adapte à questão científica e configure o microscópio. O tamanho do campo de visão é o quociente do tamanho do chip da câmera e a ampliação da lente de detecção. A lente de iluminação deve ser escolhida para que todo o campo de visão seja coberto por uma folha de luz aproximadamente planar34. Três combinações recomendadas estão listadas na T…

Representative Results

Nosso protocolo descreve uma estrutura experimental para imagens ao vivo de fluorescência comparativa em LSFMs baseados em câmara de amostra. Por exemplo, a estrutura pode ser usada para justapor (i) embriões (i) de duas ou mais espécies, (ii) embriões de linhas em que um ou mais genes são eliminados mais controles do tipo selvagem, (iii) embriões múltiplos da mesma linha transgênica, (iv) embriões de diferentes linhas transgênicas, ou (v) embriões de sublines que carregam o mesmo transgene , mas em diferente…

Discussion

Uma das áreas de aplicação exclusivas dos LSFMs é a biologia do desenvolvimento. Nesta disciplina, é importante olhar para espécimes vivos, caso contrário, processos morfogenéticos não podem ser descritos de forma dinâmica. Uma estrutura experimental para a imagem ao vivo simultânea em LSFMs baseados em câmara de amostras, como descrito aqui, é conveniente por duas razões principais.

A variância ambiente, que é inevitável em imagens vivas sequenciais, pode ser tratada proativa…

Materials

6-well plate	Orange Scientific	4430500
24-well plate	Orange Scientific	4430300	Only for live imaging involving Tribolium
35-mm Ø Petri dish	Fisher Scientific	153066	Only for live imaging involving Drosophila.
90-mm Ø Petri dish	Fisher Scientific	L9004575
100-µm mesh size cell strainer	BD Biosciences	352360
250-µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-038	Only for live imaging involving Tribolium
300-µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-040	Only for live imaging involving Tribolium
710-µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-050	Only for live imaging involving Tribolium
800-µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-051	Only for live imaging involving Tribolium
405 fine wheat flour	Demeter e.V.	SP061006	Only for live imaging involving Tribolium
commercially available Drosophila medium	Genesee Scientific	66-115	Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used
fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø	Thermo Fisher Scientific	T7282
inactive dry yeast	Genesee Scientific	62-108	Only for live imaging involving Tribolium
low-melt agarose	Carl Roth	6351.2
narrow vials	Genesee Scientific	32-109	Only for live imaging involving Drosophila
small paint brush	VWR International	149-2121
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl	Carl Roth	9062.3	Caution: sodium hypochlorite is corrosive
whole wheat flour	Demeter e.V.	SP061036	Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour
wide vials	Genesee Scientific	32-110	Only for live imaging involving Drosophila