JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Örnek Oda Bazlı Işık Tabakası Floresan Mikroskoplarında Birden Fazla Böcek Embriyosunun EşZamanlı Canlı Görüntülenmesi

Published: September 09, 2020
doi:
10.3791/61713
, ,
1Physical Biology/Physikalische Biologie (IZN, FB15), Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes (CEF – MC),Goethe-Universität

Summary

Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi gelişim biyolojisinde en değerli araçtır. Karşılaştırmalı çalışmalarda önemli bir konu ortam değişkenliğidir. Protokolümüz, birden fazla örneğin eşzamanlı canlı görüntülenmesi için deneysel bir çerçeveyi açıklar ve bu nedenle bu sorunu pro-aktif olarak ele alıp gidermektedir.

Abstract

Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi, karmaşık süreçleri biyolojik olarak ilgili birden fazla ölçekte incelemek için verimli çözümler sunar. Numunenin üç boyutlu bütünlüğünü korumak için özel olarak tasarlanmış ve genellikle numune rotasyonu özelliğine sahip numune odası bazlı kurulumlar, gelişimsel biyolojide en iyi seçimdir. Örneğin, meyve sineği Drosophila melanogaster ve kırmızı un böceği Tribolium castaneum’untüm embriyonik morfogenezini belgelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, mevcut birçok canlı görüntüleme protokolü tek embriyolar için sadece deneysel çerçeveler sağlar. Özellikle karşılaştırmalı çalışmalar için, bu tür yaklaşımlar sakıncalıdır, çünkü ardışık olarak görüntülenmiş örnekler ortam varyansı tarafından etkilenir. Ayrıca, bu, belirli bir süre içinde test edilebilen numune sayısını sınırlar. Numune odası tabanlı kurulumlarda verimi artıran ve böylece tüm numuneler için benzer ortam koşulları sağlayan eşzamanlı canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeve sunuyoruz. İlk olarak, ışık tabakası floresan mikroskopları için bir kalibrasyon kılavuzu sunuyoruz. İkincisi, birden fazla embriyo için örnek rotasyonu ile uyumlu bir montaj yöntemi öneriyoruz. Üçüncü olarak, drosophilaörnek üç boyutlu canlı görüntüleme veri kümeleri sağlar Floresan etiketli çekirdekleri ile üç transgenik çizgi yan yana, yanı sıra Tribolium, hangi aynı transgene taşıyan üç transgenik alt çizginin performansını karşılaştırırız, ancak farklı genomik konumlarda. Protokolümüz, sıralı canlı görüntülemede her zaman mevcut olan ortam farkını pro-aktif olarak ele aldığı için karşılaştırmalı çalışmalar için özel olarak tasarlanmıştır. Bu, özellikle, örneğin nakavt deneylerinden kaynaklanan anormal fenotiplerin nicel analizleri ve karakterizasyonu için önemlidir. Ayrıca, ışık tabakası floresan mikroskoplarına erişim sınırlı olduğunda son derece uygun olan genel verimi arttırır. Son olarak, önerilen montaj yöntemi, temel olarak optimizasyon çabası olmadan diğer böcek türleri ve zebra balığı gibi diğer model organizmalar için uyarlanabilir.

Introduction

Floresan mikroskopi, yaşam bilimlerinde, özellikle hücre ve gelişim biyolojisinde en temel görüntüleme tekniklerinden biridir. 1990’larınortalarından beri üç boyutlu floresan görüntüleme için son teknoloji ürünü olan konfokal floresan mikroskoplar 1’de, florofor ekscitasyonu ve emisyon ışığı algılama için aynı lens kullanılır. Aydınlatma lazer ışını, aydınlatma/algılama ekseni boyunca tüm floroforları heyecanlandırır ve ilgili odak dışı sinyal bir iğne deliği tarafından algılanmadan önce ayırt edilir. Bu nedenle, her iki boyutlu görüntü için, tüm örnek aydınlatılır. Sonuç olarak, her üç boyutlu görüntü için, yani, mekansal olarak ardışık iki boyutlu görüntüler yığını, tüm örnek birkaç düzine ila birkaç yüz kez aydınlatılır2, bu da fotobleaching ve fototoksikliği teşvik eder3.

Neredeyse yirmi yıl önce, ışık tabakası tabanlı teknoloji4, üç boyutlu floresan görüntüleme için umut verici bir alternatif olarak ortaya çıktı ve böylece gelişim biyolojisinde değerli bir araç haline geldi5. Bu yaklaşımda aydınlatma ve algılama ayrılmıştır. Aydınlatma lensi, dik olarak düzenlenmiş algılama lensinin odak düzleminde sadece birkaç mikrometre derinliğe sahip bir ışık tabakası oluşturmak için kullanılır. Bu nedenle, her iki boyutlu görüntü için, odak düzleminin etrafında yalnızca ince bir düzlemsel hacim yanar. Sonuç olarak, her üç boyutlu görüntü için, tüm örnek sadece bir kez aydınlatılır, bu da fotobleaching ve fototoksikliği kuvvetle azaltır6. Bu nedenle, ışık tabakası floresan mikroskopları (LSFM’ler) karmaşık süreçleri biyolojik olarak ilgili birden fazla ölçekte incelemek için etkili çözümler sunar ve bu nedenle, birkaç milimetre kadar büyük örneklerin hücre altı düzeyde analiz edilmesi gereken gelişim biyolojisinde özel bir değere sahiptir.

Tarihsel olarak, LSFM’ler örnek oda bazlıolmuştur 7,8. Bu kurulumlarda, aydınlatma (x) ve algılama (z) eksenleri genellikle yerçekimi eksenine (y) dik olarak düzenlenir. Örnek odalar geniş deneysel özgürlük sunar. İlk olarak, çevreyi kontrol etmek için, örneğin belirli bir sıcaklık9’u korumak veya biyokimyasal stresörler uygulamak için bir perfüzyon sisteminin kullanımını kolaylaştıran büyük görüntüleme tampon kapasiteleri sağlarlar. Ayrıca, numunenin üç boyutlu, bazı durumlarda dinamik11 , bütünlüğünü korurken ilgili deneysel ihtiyaçlara göre uyarlanmış özelleştirilmiş montaj yöntemleri10’udesteklerler. Ek olarak, numune odası tabanlı kurulumlar genellikle numuneleri y ekseni etrafında döndürmek ve böylece iki, dört veya daha fazla yön boyunca görüntülemek için kullanılan bir döndürme işlevi ile donatılmıştır. Yaygın olarak kullanılan model organizmaların embriyoları mikroskopi bağlamında, ventral-dorsal, lateral ve/veya ön-arka vücut eksenleri boyunca nispeten büyük, ardışık görüntüleme daha kapsamlı bir temsil sağlar. Bu, örneğin, karmaşık üç boyutlu geçiş yolları12,13boyunca hareket eden hücrelerin uzun süreliizlenmesinisağlar.

Işık tabakası bazlı floresan mikroskopi, Drosophila melanogasterembriyonik morfogenezini incelemek için hem sistematik olarak14,15 hem de gelişimin biyofizik yönlerine özel bir odakla kapsamlı bir şekilde uygulanmıştır. Örneğin, mikrop bandı uzaması16 ve daha fazla sırasında endoderm invaginasyonu ile eksen uzantısı arasında biyomekanik bir bağlantı tespit etmek için yüksek çözünürlüklü morfogenetik verileri toplamak için kullanıldı, karmaşık hücresel akışı gastrülasyon sırasında kuvvet oluşturma desenleri ile ilişkilendirmek için17. Ayrıca, epidermis18’dekiön-arka desenleme sırasında Wnt sinyalinin düzenlenmesini araştırmak için optogenetik gibi diğer son teknoloji tekniklerle birleştirilmiştir.

Bununla birlikte, sadece bir türü incelemek, gelişimin evrimi hakkında fikir vermez. Filogenetik bağlamda embriyogenez anlamak için alternatif böcek modeli organizmalarla yoğun araştırmalar yapılmıştır. En kapsamlı olarak araştırılan türlerden biri kırmızı un böceği Tribolium castaneum, ekonomik olarak ilgili bir depolanmış tahıl zararlısı19Embriyonik morfogenez de LSFM20ile sistematik olarak görüntülenmiştir. Bu iki türün embriyonik morfogenezleri, segmentasyon modu21gibi çeşitli yönlerden ve ekstra embriyonik membranların oluşumu ve bozulması22. İkinci yön zaten LSFM’ler kullanılarak kapsamlı bir şekilde analiz edilmiştir. Örneğin, Tribolium embriyosunu embriyogenezinin daha iyi kısmı için çeşitli tehlikelerden koruyan ekstra embriyonik bir doku olan serosanın23,24, ayrıca dorsal kapatma sırasında kendi çekilme işlemi için morfogenetik “sürücü” görevi aldığı gösterilmiştir25. Ayrıca, gastrülasyon sırasında, blastoderm’in belirli bir bölgesinin asimetrik doku hareketleri oluşturmak için vitellin zarı bağlı kaldığı gösterilmiştir26 ve bu gözlemin ardından, bölgeselleştirilmiş doku akışkanlaştırması, hücrelerin serosa pencere kapanması sırasında sırayla serosa kenarından ayrılmasına izin verir27.

Yukarıda belirtilen tüm Drosophila– ve Triboliumile ilişkili çalışmalarda, örnek oda bazlı LSFM’ler kullanılmıştır. Çoğu zaman, embriyolar örnek dönüş fonksiyonu kullanılarak birden fazla yönde kaydedildi. Açıkça belirtilmemiş olsa da, Tribolium20,28‘deki önceki çalışmalarımıza benzer şekilde, sıralı canlı görüntüleme testlerinde tek tek ve böylece birbirlerinden bağımsız olarak kaydedildikleri varsayılabilir. Bazı senaryolarda, böyle bir yaklaşım kabul edilebilir, ancak özellikle nicel karşılaştırmalı yaklaşımlarda ortam varyansı sonuçları bozabilir. Örneğin, böceklerin gelişim hızının sıcaklığa bağlı olduğu uzun zamandır bilinmektedir29, ancak daha yeni bir çalışma drosophila‘da sıcaklığın morfojenlerin konsantrasyonu30‘ u da etkileyebileceğini göstermektedir. Sonuç olarak, embriyogenezin belirli özellikleri, örneğin hücrelerin dinamik oranları, bölünme oranları ve göç hızları tam olarak ölçülmelidir, ortam varyansı olmadan yeterli tekrarlar gereklidir. Bu, standart sapmaları ve standart hataları en aza indirir, bu da diğer, hatta marjinal olarak farklı deneysel koşullarla yan yana gelmeyi kolaylaştırır.

Ancak, örnek oda tabanlı LSFM’ler öncelikle yüksek aktarım hızı tahlilleri yerine yüksek içerik için tasarlanmıştır. Tipik olarak mikroskopi slaytları, Petri kapları ve kuyu plakaları için standart kelepçe mekanizmaları ile donatılmış konfokal mikroskopların aksine, neredeyse tüm numune odası tabanlı LSFM’ler silindir bazlı kelepçe mekanizmaları kullanır. Bu mekanizmalar, rotasyon uyumlu ve invaziv olmayan10olan özel yapım numune tutucular için tasarlanmıştır, ancak genellikle birden fazla örnek20,31,32için tasarlanmamıştır. Örnek oda bazlı kurulumların avantajlarından ödün verilmeyen iki veya daha fazla embriyonun eşzamanlı canlı görüntülenmesi için bir çerçeve, ortam farkı sorununu ele alarak karşılaştırmalı çalışmalar için LSFM’lerin değerini artırır.

Protokolümüzde, embriyoları “istiflemek” için bir seçenek olarak y ekseninin kullanıldığı örnek oda bazlı LSFM’lerde (Şekil 1A)karşılaştırmalı canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeve sunuyoruz. İlk olarak, özellikle kalibrasyon asistanı olmayan cihazlar için önemli olan numune odası tabanlı LSFM’ler için floresan mikrokürez bazlı kalibrasyon kılavuzu sunuyoruz. İkinci olarak, örümcek ağı tutucusu28 ‘e (Şekil 1B) dayanan ve numune rotasyonu ile uyumlu olan ve böylece birden fazla numunenin birden fazla yönde eşzamanlı görüntülenmesine izin veren birden fazla embriyo için bir montaj yöntemi açıklıyoruz (Şekil 1C). Birkaç embriyo ince bir agarose filminin üzerine hizalanır ve örnek odaya yerleştirildikten sonra, üç boyutlu görüntüler elde etmek için ışık tabakasında art arda hareket eder. Üçüncü olarak, Drosophila ve Triboliumiçin üç örnek canlı görüntüleme veri kümesi sunuyoruz. İlki için, transgenik çizgileri floresan etiketli çekirdeklerle yan yana alıyoruz. İkincisi için, aynı transgeneyi taşıyan transgene, ancak farklı genomik konumlarda transgene alt çizgilerinin performansını karşılaştırıyoruz. Son olarak, karşılaştırmalı canlı görüntüleme ve ortam varyansı ile paralelleşmenin önemini tartışıyoruz33Deneysel çerçevemizin aktarım hızı sınırını tartışıyor ve yaklaşımımızın diğer model organizmalara adaptasyonunu değerlendiriyoruz.

Protocol

1. Hazırlık çalışmaları LSFM için bilimsel soruya uygun bir aydınlatma lensi/algılama lensi/kamera kombinasyonu seçin ve mikroskobu ayarlayın. Görüş alanının boyutu, kamera yongası boyutunun bölümü ve algılama lensinin büyüttürüdür. Aydınlatma lensi seçilmelidir, böylece tüm görüş alanı kabaca düzlemsal bir ışık levhası ile kaplanır34. Önerilen üç kombinasyon Tablo 1’de listelenmiştir. Agarose aliquots ve alma yemekle…

Representative Results

Protokolümüz, örnek oda bazlı LSFM’lerde karşılaştırmalı floresan canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeveyi tanımlamaktadır. Örneğin, çerçeve (i) iki veya daha fazla türün embriyolarını, (ii) bir veya daha fazla genin nakavt edildiği çizgilerin embriyolarını ve vahşi tip kontrolleri, (iii) aynı transgenik çizgideki birden fazla embriyoyu, (iv) farklı transgenik çizgilerden embriyoları veya (v) aynı transjeni taşıyan alt hatlardan embriyoları yan yana getirmek için kullanılabi…

Discussion

LSFM’lerin münhasır uygulama alanlarından biri gelişimsel biyolojidir. Bu disiplinde, canlı örneklere bakmak önemlidir, aksi takdirde morfogenetik süreçler dinamik bir şekilde tarif edilemez. Örnek oda bazlı LSFM’lerde eşzamanlı canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeve, burada açıklandığı gibi, iki ana nedenden dolayı uygundur.

Sıralı canlı görüntülemede kaçınılmaz olan ortam varyansı pro-aktif olarak ele alınabiliyor. Böcek embriyosu ile ilişkili can…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ernst H. K. Stelzer’e, kaynaklarını kullanma fırsatının yanı sıra el yazması ile ilgili değerli yorumları için, Tribolium canlı görüntüleme desteği için Anita Anderl’e, teknik destek için Sven Plath’a ve Bloomington Stock Center aracılığıyla transgenik Drosophila hatlarını paylaştıkları için Ilan Davis, Nicole Grieder ve Gerold Schubiger’e teşekkür ederiz.

Materials

6-well plate Orange Scientific 4430500  
24-well plate Orange Scientific 4430300 Only for live imaging involving Tribolium
35-mm Ø Petri dish Fisher Scientific 153066 Only for live imaging involving Drosophila.
90-mm Ø Petri dish Fisher Scientific L9004575
100-µm mesh size cell strainer BD Biosciences 352360
250-µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-038 Only for live imaging involving Tribolium
300-µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-040 Only for live imaging involving Tribolium
710-µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-050 Only for live imaging involving Tribolium
800-µm mesh size sieve VWR International 200.025.222-051 Only for live imaging involving Tribolium
405 fine wheat flour Demeter e.V. SP061006 Only for live imaging involving Tribolium
commercially available Drosophila medium Genesee Scientific 66-115 Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used
fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø Thermo Fisher Scientific T7282
inactive dry yeast Genesee Scientific 62-108 Only for live imaging involving Tribolium
low-melt agarose Carl Roth 6351.2
narrow vials Genesee Scientific 32-109 Only for live imaging involving Drosophila
small paint brush VWR International 149-2121
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl Carl Roth 9062.3 Caution: sodium hypochlorite is corrosive
whole wheat flour Demeter e.V. SP061036 Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour
wide vials Genesee Scientific 32-110 Only for live imaging involving Drosophila
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), 2-5 (2005).
  2. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
  3. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003 (2017).
  4. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
  5. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
  6. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
  7. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  8. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  9. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
  10. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
  11. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
  12. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
  13. Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
  14. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  15. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
  16. Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292 (2015).
  17. Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454 (2018).
  18. Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636 (2017).
  19. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  20. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
  21. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
  22. Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
  23. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082 (2013).
  24. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111 (2014).
  25. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834 (2016).
  26. Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
  27. Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193 (2019).
  28. Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629 (2017).
  29. Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
  30. Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
  31. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
  32. Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
  33. Mcdonald, J. H. . Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , (2013).
  34. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
  35. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  36. Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677 (2018).
  37. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
  38. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
  39. vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
  40. Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240 (2017).
  41. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
  42. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  43. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
  44. He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065 (2019).
  45. Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
  46. Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
  47. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , (1997).
  48. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
  49. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
  50. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555 (2014).
  51. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
  52. Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
  53. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
  54. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  55. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
  56. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
  57. Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
  58. Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616 (2018).
  59. Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
  60. Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
  61. Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194 (2018).

Tags

Keywords: Light Sheet Fluorescence MicroscopySample ChamberCobweb HolderFluorescent MicrospheresEmbryo DechorionationSimultaneous Live ImagingHigh Content ImagingCalibrationAxial Resolution
check_url/kr/61713?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ratke, J., Krämer, F., Strobl, F. Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes. J. Vis. Exp. (163), e61713, doi:10.3791/61713 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image