4 डी माइक्रोस्कोपी: नोमार्स्की माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके Caenorhabditis elegans भ्रूण विकास को उजागर करना
Summary
यहां, हम Caenorhabditis elegans भ्रूण को तैयार करने और बढ़ते करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, 4 डी माइक्रोस्कोप के तहत विकास को रिकॉर्ड करते हैं और सेल वंश का पता लगाते हैं।
Abstract
4 डी माइक्रोस्कोपी विभिन्न जानवरों में भ्रूण विकास प्रक्रिया को उजागर करने के लिए एक अमूल्य उपकरण है। पिछले दशकों में, Caenorhabditis elegans विकास का अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छे मॉडल में से एक के रूप में उभरा है। ऑप्टिकल दृष्टिकोण से, इसका आकार और पारदर्शी शरीर इस नेमाटोड को डीआईसी (डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट या नोमार्स्की) माइक्रोस्कोपी के लिए एक आदर्श नमूना बनाता है। यह लेख सी एलिगन्स नेमाटोड को बढ़ाने, उनके भ्रूण को तैयार करने और बढ़ाने, 4 डी माइक्रोस्कोपी और सेल वंश ट्रेसिंग करने के लिए एक प्रोटोकॉल दिखाता है। विधि नोमार्स्की छवियों के मल्टीफोकल टाइम-लैप्स रिकॉर्ड और विशिष्ट सॉफ़्टवेयर के साथ विश्लेषण पर आधारित है। यह तकनीक सेलुलर स्तर पर भ्रूण विकासात्मक गतिशीलता का खुलासा करती है। उत्परिवर्ती में किसी भी भ्रूण दोष, जैसे कि स्पिंडल अभिविन्यास, सेल माइग्रेशन, एपोप्टोसिस या सेल भाग्य विनिर्देश में समस्याएं, कुशलतापूर्वक पता लगाया जा सकता है और स्कोर किया जा सकता है। भ्रूण की लगभग हर एक कोशिका का पालन उस क्षण तक किया जा सकता है जब भ्रूण स्थानांतरित होना शुरू हो जाता है। 4 डी डीआईसी माइक्रोस्कोपी द्वारा सी एलिगन्स भ्रूण के पूर्ण सेल वंश का पता लगाना श्रमसाध्य है, लेकिन विशिष्ट सॉफ़्टवेयर का उपयोग इस कार्य को बहुत सुविधाजनक बनाता है। इसके अलावा, इस तकनीक को प्रयोगशाला में लागू करना आसान है। 4 डी माइक्रोस्कोपी एक बहुमुखी उपकरण है और भ्रूण के विकास का एक अद्वितीय विश्लेषण करने की संभावना को खोलता है।
Introduction
4 डी माइक्रोस्कोपी एक मल्टीफोकल टाइम-लैप्स रिकॉर्डिंग सिस्टम है जो शोधकर्ताओं को स्थानिक रूप से और समय के साथ जैविक नमूने की सेल गतिशीलता को पंजीकृत करने और मापने की अनुमति देता है। सेल संस्कृतियों, खमीर या जीवित ऊतकों को 4 डी विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है लेकिन यह तकनीक विशेष रूप से जीवित भ्रूण के विकास का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है। इस विश्लेषण का संकल्प भ्रूण की हर एक कोशिका के स्तर तक पहुंचता है। प्रत्येक सेल विभाजन का पता लगाया जा सकता है, और समय के साथ सेल आंदोलनों का पता लगाया जा सकता है। कोशिकाओं के भाग्य का मूल्यांकन उस स्थिति और आकार के अनुसार किया जाता है जो कोशिकाएं प्राप्त करती हैं। नोमार्स्की ऑप्टिक्स का उपयोग ऑर्थोगोनल रूप से ध्रुवीकृत प्रकाश बीम का उपयोग करके बिना दाग वाले पारदर्शी नमूनों के विपरीत को बढ़ाता है जो फोकल प्लेन में हस्तक्षेप करते हैं। परिणामी छवियां तीन आयामी दिखाई देती हैं, जो एक तरफ प्रकाशित होती हैं।
नाभिक का स्वत: पता लगाने और सेल वंशों के उत्पादन के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और जीएफपी ट्रांसजेनिक जानवरों के उपयोग पर आधारित अन्य तरीकों कोविकसित किया गया है। उन प्रणालियों का लाभ स्पष्ट है: सॉफ़्टवेयर समय की अवधि में प्रत्येक नाभिक को मैन्युअल रूप से चिह्नित करने की आवश्यकता को बहुत अधिक ओवरराइड करता है (हालांकि देर से चरणों के दौरान कुछ मैनुअल पर्यवेक्षण की आवश्यकता होती है)। हालांकि, सेल आकार या झिल्ली गतिशीलता में परिवर्तन से जुड़ी सेलुलर प्रक्रियाएं, जैसे कि सेल भेदभाव, प्रवासन, एपोप्टोसिस या लाश निगलने के दौरान होने वाली प्रक्रियाएं, फ्लोरोसेंट-लेबल वाली नाभिक छवियों में एक काली पृष्ठभूमि के रूप में छिपी रहती हैं।
इसके विपरीत, 4 डी नोमार्स्की माइक्रोस्कोपी (जिसे डीआईसी माइक्रोस्कोपी, डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी भी कहा जाता है) नाभिक और सेल आकार दोनों परिवर्तनों को दिखाता है जो जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती जानवरों के विकास के दौरान होते हैं। यह मानक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल वंश ट्रेसिंग की अनुमति देता है, केवल संचारित प्रकाश को नियोजित करता है। विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाने के अलावा ट्रांसजेनिक जानवरों का उपयोग करने की कोई सामान्य आवश्यकता नहीं है, जिस मामले में फ्लोरोसेंट स्कैन को इंटरकैलेटेड किया जा सकता है। इसलिए, यह गतिशील सेल प्रक्रियाओं जैसे भ्रूणजनन या एपोप्टोसिस पर काम करने वाली कई प्रयोगशालाओं के लिए इष्टतम दृष्टिकोण हो सकता है जिसे डीआईसी माइक्रोस्कोपी 3,4,5,6,7 के तहत हाइलाइट किया जा सकता है।
कई लचीले और उपयोगकर्ता के अनुकूल कार्यक्रम माइक्रोस्कोपिक छवियों को कैप्चर करने और रिकॉर्ड किए गए नमूने में सेल वंश, 3 डी मॉडल, सेल माइग्रेशन पथ, आदि के पुनर्निर्माण के लिए उपलब्ध हैं। एक मानक प्रयोग में, छवियों को फोकल विमानों की एक श्रृंखला में अधिग्रहित किया जाता है, एक स्थिर दूरी पर, जिसकी संख्या नमूना मोटाई पर निर्भर करती है। विश्लेषण के अस्थायी संकल्प स्कैन आवृत्ति में वृद्धि के द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है। कंप्यूटर भंडारण क्षमता के अलावा रिकॉर्डिंग की अवधि के लिए वस्तुतः कोई सीमा नहीं है। उदाहरण के लिए, C. elegans भ्रूण विकास विश्लेषण के लिए, हम नियमित रूप से 30 फोकल विमानों (1 माइक्रोन-चरण प्रत्येक) पर छवियों को प्राप्त करते हैं, 12 घंटे के लिए हर 30 सेकंड में।
इन प्रणालियों को कई जानवरों के भ्रूण के विश्लेषण पर लागू किया गया है जैसे कि केनोरहाबडिटिस एलिगन्स 8,9,10, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर11, अन्य नेमाटोड भ्रूण12,13, टार्डीग्रेड14,15 और यहां तक कि शुरुआती माउस भ्रूण16। एकमात्र आवश्यकता माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड तैयारी पर विकसित करने में सक्षम एक पारदर्शी भ्रूण होना है।
संक्षेप में, डीआईसी आधारित 4 डी माइक्रोस्कोपी 1) छोटे, पारदर्शी जानवरों के भ्रूण विकास का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है: सेल वंश, सेल माइग्रेशन पथों का पता लगाना, 3 डी मॉडल उत्पन्न करना, आदि; 2) जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को परिभाषित करना; 3) सेल संस्कृति गतिशीलता का अध्ययन, खमीर से मानव कोशिकाओं के लिए; 4) ऊतक गतिशीलता या भ्रूण के टुकड़ों का विश्लेषण; 5) कोशिका मृत्यु कैनेटीक्स और लाश निगलने की मात्रा; और 6) भ्रूण विकास ता्मक विशेषताओं के आधार पर तुलनात्मक फाइलोजेनी विश्लेषण करना। यदि इनमें से किसी भी विषय (या समान वाले) में रुचि है, तो 4 डी माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आधुनिक जीव विज्ञान में प्रमुख चुनौतियों में से एक बहुकोशिकीय जीवों के विकास को समझना है। C. elegans विकासशील भ्रूण में सेल प्रसार और सेल भेदभाव के बीच ठीक समन्वय का अध्ययन करने के लिए सबसे उपयुक्त मॉडल में से एक के रूप में उभरा है। ऑप्टिकल दृष्टिकोण से, इसका पारदर्शी शरीर और इसका छोटा आकार इस सूत्रकृमि को डीआईसी माइक्रोस्कोपी के लिए एक आदर्श नमूना बनाता है। इसी तरह की विशेषताओं वाले अन्य जीवों को भी 4 डी माइक्रोस्कोपी विश्लेषण 11,12,13,14,15,16 के अधीन किया गया है।
उन विकासात्मक अध्ययनों के लिए, या तो आगे या रिवर्स आनुवांशिकी द्वारा जीन निष्क्रियता भ्रूणजनन में इसकी भागीदारी के लिए एक सुराग प्रदान करती है। एक बार जब एक जीन विकास में भूमिका निभाने के लिए साबित हो जाता है, तो अगला कदम सही शरीर योजना की स्थापना में अपनी सटीक भूमिका को परिभाषित करना है। Immunostaining अधिकांश मॉडलों के लिए चयनित दृष्टिकोण है। यह तकनीक सेल भेदभाव या विशिष्ट मार्करों की अभिव्यक्ति में समस्याओं को स्पष्ट करती है। हालांकि, इस दृष्टिकोण की एक प्रमुख सीमा यह है कि यह केवल विकास में एक निश्चित बिंदु पर एक या अधिक मार्करों की अभिव्यक्ति का एक स्थिर दृश्य प्रदान करता है। विकास के दौरान इन मार्करों का एक गतिशील दृश्य केवल अलग-अलग समय बिंदुओं पर विभिन्न भ्रूणों को धुंधला करके प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, इस तरह के निश्चित नमूनों में सेल वंश पुनर्निर्माण संभव नहीं है।
4 डी माइक्रोस्कोपी भ्रूण विकास का अध्ययन करने के लिए एक पूरक दृष्टिकोण है। यह तकनीक एक सेल स्तर के संकल्प पर विकास गतिशीलता का खुलासा करती है। भ्रूण में कोई भी दोष जैसे कि स्पिंडल अभिविन्यास, सेल माइग्रेशन, एपोप्टोसिस, सेल भाग्य विनिर्देश, आदि में समस्याएं एक 4 डी फिल्म में दिखाई देंगी जिसे शोधकर्ता द्वारा आगे और पीछे की ओर देखा जा सकता है, मात्रा और स्कोर किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग करते हुए, भ्रूण में लगभग प्रत्येक कोशिका का पालन उस क्षण तक किया जा सकता है जब भ्रूण स्थानांतरित होना शुरू हो जाता है। भ्रूण केवल दृश्य प्रकाश और नोमार्स्की ऑप्टिक्स के साथ 4 डी माइक्रोस्कोपी के अधीन होते हैं, जो फोटोडैमेज का सामना नहीं करते हैं। फ्लोरोसेंट स्कैन को रिकॉर्डिंग के भीतर भी इंटरकैलेटेड किया जा सकता है ताकि यह पता लगाया जा सके कि जीन कब और कहां व्यक्त किया जाता है। भ्रूण जो महत्वपूर्ण फोटोडैमेज से पीड़ित होते हैं, उन्हें सेल चक्र विस्तार द्वारा पहचाना जाता है जो एक मानक डब्ल्यूटी वंश भ्रूण की तुलना में मजबूत यूवी विकिरण का कारण बनता है। उस मामले में, फोटोडैमेज को यूवी लैंप तीव्रता को कम करके और कैमरे की संवेदनशीलता या एक्सपोजर समय को बढ़ाकर कम किया जा सकता है। रूपात्मक विशेषताएं और आणविक मार्कर किसी भी उत्परिवर्ती के भ्रूण विकास को स्पष्ट करने में मदद कर सकते हैं।
एक 4 डी माइक्रोस्कोपी प्रणाली की स्थापना प्रयोगशाला में लागू करना आसान है और, कुछ अभ्यास के बाद, सेल गतिशीलता और सेल संस्कृतियों के वंश अनुरेखण और माइक्रोस्कोप क्षेत्र में प्रत्येक सेल के संकल्प स्तर पर पारदर्शी नमूनों को जीवित करने का एक बेजोड़ विश्लेषण सक्षम बनाता है। डीआईसी छवियों पर सेल वंश अनुरेखण अभी भी हाथ से संसाधित किया जाता है। यह समय लेने वाला है और, हालांकि सॉफ़्टवेयर वंश त्रुटियों का पता लगाता है जैसे कि एक ही सेल को चिह्नित करने वाली विभिन्न वंश शाखाएं, गलतियां संभव हैं। जबकि जीएफपी-लेबल कोशिकाओं का स्वचालित पता लगाना अच्छी तरह से विकसित किया गया है2, अचिह्नित कोशिकाओं और दृश्यमान प्रकाश छवियों के आधार पर पूरक वंश अनुरेखण सॉफ्टवेयर अभी भी प्रारंभिक चरण में है और पूर्ण भ्रूण विश्लेषण के लिए वास्तव में उपयोगी नहीं है। किसी भी संदेह के बिना, दृश्यमान प्रकाश माइक्रोस्कोपी के क्षेत्र में छवि पहचान प्रणालियों का आवेदन इस क्षेत्र में एक महान प्रगति लाएगा।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक Rioja Salud फाउंडेशन (Fondos FEDER) और स्पेनिश Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00) से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं। Cristina Romero Aranda AECC (Asociación Española Contra el Cáncer) से एक फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित है।
Materials
| Caenorhabditis elegans (N2) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | N2 | WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis elegans (VZ454) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | VZ454 | gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
| Cell Lineage Tracing software | SIMI | Simi BioCell | This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html |
| Microscope camera | Hamamatsu | Orca-R2 | Miscroscope camera for both transmitted and UV light |
| Microscope control software | Caenotec | Time to Live | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel Kleine Dorfstr. 9 38312 Börßum, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de |
| Microscope control software | Micro-manager | Micro-manager | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/ |
| Motorized microscope | Leica | Leica DM6000 | Motorized upright microscope to perform 4D microscopy |
| Standard equipment in a Molecular Biology lab. | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZ16FA | Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos. |
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