여기에서, 우리는 Caenorhabditis elegans embryos 를 준비하고 장착하고, 4D 현미경으로 개발을 기록하고 세포 계보를 추적하기위한 프로토콜을 제시합니다.
4D 현미경 검사는 다른 동물에서 배아 발달 과정을 풀기위한 귀중한 도구입니다. 지난 수십 년 동안 Caenorhabditis elegans 는 개발을 연구하기위한 최고의 모델 중 하나로 부상했습니다. 광학적 관점에서 볼 때, 크기와 투명한 몸체는이 선충류를 DIC (차동 간섭 대비 또는 Nomarski) 현미경 검사에 이상적인 표본으로 만듭니다. 이 기사는 C. elegans 선충류를 성장시키고, 배아를 준비 및 장착하고, 4D 현미경 검사 및 세포 계보 추적을 수행하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 Nomarski 이미지의 다초점 타임랩스 기록 및 특정 소프트웨어를 사용한 분석을 기반으로 합니다. 이 기술은 세포 수준에서 배아 발달 역학을 보여줍니다. 스핀들 배향, 세포 이동, 아폽토시스 또는 세포 운명 사양의 문제와 같은 돌연변이체의 모든 배아 결함은 효율적으로 검출되고 점수가 매겨질 수 있다. 배아의 거의 모든 단일 세포는 배아가 움직이기 시작하는 순간까지 추적 할 수 있습니다. 4D DIC 현미경으로 C. elegans 배아의 전체 세포 계보를 추적하는 것은 힘들지 만 특정 소프트웨어를 사용하면 이러한 작업이 크게 용이합니다. 또한이 기술은 실험실에서 쉽게 구현할 수 있습니다. 4D 현미경 검사는 다목적 도구이며 배아 발달에 대한 비교할 수없는 분석을 수행 할 수있는 가능성을 열어줍니다.
4D 현미경 검사는 다초점 타임랩스 기록 시스템으로, 연구자가 생물학적 샘플의 세포 역학을 공간적으로나 시간이 지남에 따라 등록하고 정량화할 수 있습니다. 세포 배양, 효모 또는 살아있는 조직은 4D 분석을 거칠 수 있지만이 기술은 살아있는 배아의 발달을 분석하는 데 특히 적합합니다. 이 분석의 해상도는 배아의 모든 단일 세포 수준에 도달합니다. 각 세포 분열을 감지 할 수 있으며 시간이 지남에 따라 세포 움직임을 추적 할 수 있습니다. 세포 운명은 세포가 획득하는 위치와 모양에 따라 평가됩니다. Nomarski 광학의 사용은 초점면을 방해하는 직교 편광 광선을 사용하여 염색되지 않은 투명 샘플의 대비를 향상시킵니다. 결과 이미지는 입체적으로 보이며 한쪽에 조명됩니다.
핵의 자동 검출 및 세포 계보의 생성을 위한 공초점 현미경 및 GFP 트랜스제닉 동물의 사용에 기초한 다른 방법들이 개발되었다 1,2. 이러한 시스템의 장점은 분명합니다 : 소프트웨어는 일정 기간 동안 각 핵을 수동으로 표시 할 필요성을 크게 무시합니다 (후기 단계에서는 수동 감독이 필요하지만). 그러나, 세포 분화, 이동, 아폽토시스 또는 시체 삼킴 동안 발생하는 것과 같은 세포 형태 또는 막 역학의 변화를 수반하는 세포 과정은 형광 표지된 핵 이미지에서 검은 배경으로서 숨겨져 있다.
대조적으로, 4D Nomarski 현미경 (DIC 현미경, 차등 간섭 대조 현미경이라고도 함)은 야생형 또는 돌연변이 동물의 발달 중에 발생하는 핵 및 세포 모양 변화를 보여줍니다. 이를 통해 표준 현미경을 사용하여 세포 계보를 추적 할 수 있으며 투과 된 빛 만 사용합니다. 특정 발현 패턴을 보이는 것 외에는 일반적으로 트랜스제닉 동물을 사용할 필요가 없으며, 이 경우 형광 스캔이 인터칼레이션될 수 있다. 따라서 이것은 DIC 현미경 3,4,5,6,7에서 강조 표시 할 수있는 배아 발생 또는 아폽토시스와 같은 동적 세포 과정을 연구하는 많은 실험실에서 최적의 접근법이 될 수 있습니다.
현미경 이미지를 캡처하고 기록 된 샘플에서 세포 계보, 3D 모델, 세포 이동 경로 등을 재구성하기 위해 몇 가지 유연하고 사용자 친화적 인 프로그램을 사용할 수 있습니다. 표준 실험에서 이미지는 일정한 거리에서 일련의 초점면에서 수집되며, 그 수는 샘플 두께에 따라 다릅니다. 분석의 시간적 분해능은 스캔 빈도를 증가시킴으로써 최적화될 수 있다. 컴퓨터 저장 용량 이외의 녹음 기간에는 사실상 제한이 없습니다. 예를 들어, C. elegans 배아 발달 분석의 경우, 우리는 12 시간 동안 30 초마다 30 초점 평면 (각각 1 미크론 스텝)에서 이미지를 일상적으로 수집합니다.
이들 시스템은 예쁜꼬마선 충 8,9,10, 초파리 멜라노가스터 11, 다른 선충류 배아 12,13, 타르디그레이드 14,15 및 심지어 초기 마우스 배아 16과 같은 몇몇 동물 배아의 분석에 적용되었다. 유일한 요구 사항은 현미경으로 슬라이드 제제에서 개발할 수있는 투명한 배아를 갖는 것입니다.
요약하면, DIC 기반 4D 현미경 검사는 1) 작고 투명한 동물의 배아 발달 분석에 특히 유용합니다 : 세포 계보 추적, 세포 이동 경로, 3D 모델 생성 등; 2) 유전자 발현 패턴을 정의하는 단계; 3) 효모에서 인간 세포에 이르기까지 세포 배양 역학을 연구하는 단계; 4) 조직 역학 또는 배아 단편을 분석하는 단계; 5) 세포 사멸 동역학 및 시체 삼킴을 정량화하는 단계; 6) 배아 발달 특성에 기초한 비교 계통학 분석을 수행한다. 이러한 주제 (또는 유사한 주제) 중 하나에 관심이있는 경우 4D 현미경을 사용할 수 있습니다.
현대 생물학의 주요 과제 중 하나는 다세포 유기체의 발달을 이해하는 것입니다. C. elegans는 발달중인 배아에서 세포 증식과 세포 분화 사이의 미세 조정을 연구하는 데 가장 적합한 모델 중 하나로 부상했습니다. 광학적 관점에서 볼 때, 투명한 몸체와 작은 크기로이 선충류는 DIC 현미경 검사에 이상적인 표본입니다. 유사한 특성을 가진 다른 유기체들도 4D 현미경 분석11,12,13,14,15,16을 받았다.
이러한 발달 연구의 경우, 정방향 또는 역방향 유전학에 의한 유전자 불활성화는 배아 발생에 대한 단서를 제공합니다. 일단 유전자가 발달에서 중요한 역할을하는 것으로 입증되면, 다음 단계는 올바른 신체 계획의 수립에 정확한 역할을 정의하는 것입니다. 면역 염색은 대부분의 모델에 대해 선택된 접근법입니다. 이 기술은 세포 분화 또는 특정 마커의 발현의 문제를 해명한다. 그러나, 이러한 접근법의 주요 한계는 개발의 고정된 지점에서 하나 이상의 마커의 발현에 대한 정적 뷰만을 제공한다는 것이다. 발달 전반에 걸쳐 이러한 마커의 역동적 인 견해는 다른 시점에서 다른 배아를 염색함으로써 만 얻을 수 있습니다. 또한, 세포 계보 재구성은 이러한 고정된 샘플에서 가능하지 않다.
4D 현미경 검사는 배아 발달을 연구하기위한 보완적인 접근법입니다. 이 기술은 세포 수준 분해능에서 발달 역학을 드러낸다. 스핀들 방향, 세포 이동, 아폽토시스, 세포 운명 사양 등의 문제와 같은 배아의 결함은 연구자가 앞뒤로 시각화하고 정량화하고 채점할 수 있는 4D 영화에 나타날 것이다. 이 기술을 사용하면 배아의 거의 모든 세포가 배아가 움직이기 시작하는 순간까지 추적 할 수 있습니다. 가시광선과 노마르스키 광학만으로 4D 현미경을 검사받은 배아는 광손상을 입지 않습니다. 형광 스캔은 또한 유전자가 언제 어디서 발현되는지를 검출하기 위해 기록 내에서 인터칼레이션될 수 있다. 상당한 광손상을 겪는 배아는 표준 WT 계통 배아에 비해 강한 UV 조사를 일으키는 세포 주기 확장에 의해 확인된다. 이 경우 UV 램프 강도를 낮추고 카메라 감도 또는 노출 시간을 늘려 광손상을 줄일 수 있습니다. 형태학적 특성 및 분자 마커는 임의의 돌연변이체의 배아 발달을 명확히 하는 것을 도울 수 있다.
4D 현미경 시스템을 설치하는 것은 실험실에서 쉽게 구현할 수 있으며, 몇 가지 실습 후에 현미경 분야의 모든 세포의 해상도 수준에서 세포 역학 및 세포 배양 및 살아있는 투명 표본의 계보 추적에 대한 탁월한 분석을 가능하게합니다. DIC 이미지에 대한 세포 계보 추적은 여전히 손으로 처리됩니다. 시간이 많이 걸리고 소프트웨어가 동일한 셀을 표시하는 다른 계보 분기와 같은 계보 오류를 감지하더라도 실수가 발생할 수 있습니다. GFP 표지된 세포의 자동 검출이 잘 발달되어 있지만2, 표시가 없는 세포 및 가시광선 이미지를 기반으로 하는 상보적 계통 추적 소프트웨어는 아직 초기 단계에 있으며 전체 배아 분석에는 실제로 유용하지 않습니다. 의심의 여지없이, 가시 광선 현미경 분야에 이미지 인식 시스템을 적용하면이 분야에서 큰 발전을 가져올 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 Rioja Salud Foundation (Fondos FEDER)과 스페인 장관 인 Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00)의 지원을 인정하고자합니다. 크리스티나 로메로 아란다는 AECC (Asociación Española Contra el Cáncer)의 펠로우십에 의해 자금을 지원합니다.
Caenorhabditis elegans (N2) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | N2 | WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
Caenorhabditis elegans (VZ454) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | VZ454 | gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
Cell Lineage Tracing software | SIMI | Simi BioCell | This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html |
Microscope camera | Hamamatsu | Orca-R2 | Miscroscope camera for both transmitted and UV light |
Microscope control software | Caenotec | Time to Live | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel Kleine Dorfstr. 9 38312 Börßum, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de |
Microscope control software | Micro-manager | Micro-manager | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/ |
Motorized microscope | Leica | Leica DM6000 | Motorized upright microscope to perform 4D microscopy |
Standard equipment in a Molecular Biology lab. | |||
Stereomicroscope | Leica | MZ16FA | Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos. |