세균 성 내분염의 마우스 모형에 있는 감염 매개변수의 인트라비탈 주입 및 양
Summary
우리는 여기에서 세균성 내과염의 마우스 모형에 있는 intravitreal 주입 및 후속 세균량의 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 숙주 면역 반응 및 세균 및 숙주 유전자 발현을 측정하기 위해 확장될 수 있다.
Abstract
안구 세균 감염은 시력에 위험합니다. 연구원은 가능한 치료 표적을 확인하고 실명을 방지하기 위하여 약을 시험하기 위하여 감염과 관련되었던 호스트 및 세균성 요인 및 면역 반응 통로를 조사하기 위하여 동물 모형을 이용합니다. 인트라비탈 주입 기술은 유기체, 약물 또는 기타 물질을 눈의 후방 세그먼트의 유리체 구멍에 직접 주입하는 데 사용됩니다. 여기에서, 우리는 마우스 눈에서 감염을 시작하는 이 주입 기술 및 안구 내 박테리아를 정량화하는 기술을 시연했습니다. 바실러스 세레우스는 뇌 심장 주입 액체 미디어에서 18시간 동안 재배되었고 농도 100콜로 다시 매립(CFU)/0.5 μL을 하였다. C57BL/6J 마우스는 케타민과 자일라진의 조합을 사용하여 마취되었다. 피콜리터 마이크로인젝터와 유리 모세관 바늘을 사용하여, 바실러스 현탁액의 0.5 μL은 마우스 눈의 중간 유리체에 주입되었다. 금방 대조눈은 멸균 매체(외과적 통제)로 주입되었거나 주입되지 않았다(절대 제어). 감염 후 10시간 동안, 마우스는 안락사되었고, 눈은 멸균 수술 핀셋을 사용하여 수확하고 400 μL 멸균 PBS 및 1mm 멸균 유리 구슬을 포함하는 튜브에 배치되었다. ELISA 또는 골수페록시다제 아사제의 경우, 단백질 효소 억제제가 튜브에 첨가되었다. RNA 추출의 경우 적절한 용해 버퍼가 추가되었습니다. 눈은 1-2 분 동안 조직 균질화로 균질화되었다. 균질화는 PBS에서 10배 연속적으로 희석되고 한천 판에 희석된 추적을 했다. 균질의 나머지 는 추가 적인 에세이를 위해 -80°C에 저장하였다. 플레이트는 24시간 동안 배양되었고 눈당 CFU가 정량화되었습니다. 이러한 기술은 마우스 눈에 재현 가능한 감염을 초래하고 실행 가능한 박테리아의 양을 용이하게, 숙주 면역 반응, 호스트 와 세균 성 유전자 발현의 omics.
Introduction
세균성 내과염은 염증을 일으키는 치명적인 감염이며, 제대로 치료하지 않으면 시력이나 실명의 손실이 발생할 수 있습니다. 내피탈미염은1, 2,3,4,5의내부로박테리아가 들어온 결과. 일단 눈에, 박테리아 복제, 독 소 및 기타 유해 요인을 생산, 섬세 한 망막 세포와 조직에 돌이킬 수 없는 손상을 일으킬 수 있습니다. 안구 손상은 또한 염증에 의해 발생할 수 있습니다, 눈의 내부로 염증 세포 유입으로 이어지는 염증 경로의 활성화에 의해1,5,6. 내과 실증염은 안구 수술(수술 후), 눈에 관통하는 부상(외상 후), 또는 다른 해부학 부위(내인성)7,8,9,10에서박테리아의 전이성 확산을 눈으로 볼 수 있다. 세균성 내과염에 대한 치료는 항생제, 항염증제, 또는 외과적 개입3,4,11을포함한다. 이러한 치료에도 불구하고 시력이나 눈 자체가 손실 될 수 있습니다. 세균성 내막염 후의 시각적 예후는 일반적으로 치료 효과, 프레젠테이션시 시력 및 감염 유기체의 독성에 따라 달라집니다.
바실러스 세레우스(B. cereus)는외상 후 내분비염7,12를유발하는 주요 세균성 병원균 중 하나입니다. B. 세루내팔염 케이스의 대다수는 며칠 안에 실명을 초래할 수 있는 급속한 과정이 있습니다. B. 세루 내막염의 특징은 빠르게 진화하는 안구 내 염증, 눈 통증, 시력의 급속한 손실 및 발열을 포함합니다. B. 세레우스는 일반적으로 눈 감염을 일으키는 원인이 되는 그밖 박테리아에 비해 눈에서 급속하게 성장하고2,4,12 및 많은 독성 요인을 가지고 있습니다. 따라서, 성공적인 치료 내정간섭을위한 창은 상대적으로 짧은1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25입니다. 이 감염을 위한 처리는 일반적으로 그밖 보다 적게 악성 병원체에 기인한 내피세포염 취급에 성공적입니다, 그러나 B. cereus 내분비염은 일반적으로 중요한 비전 손실 때문에 손해를 입는 환자의 70% 이상 귀착됩니다. 그 환자의 대략 50%는 감염된 눈의 evisceration 또는 enucleation를겪는7,16,22,23. B. 세루의 파괴적이고 빠른 본질은 즉각적이고 적절한 처리를 요구합니다. 질병 발달의 근본적인 기계장치를 분별하는 최근 진행은내정간섭19,26,27에대한 잠재적인 표적을 확인했습니다. B. cereus 내피탈미염의 실험 마우스 모델은 감염의 메커니즘을 분별하고 시력 손실을 방지 할 수있는 잠재적 인 치료법을 테스트하는 데 계속 유용합니다.
B. 세레우스를 가진 마우스의 실험적인 안구 감염은 내피염28도중 세균성 및 호스트 요인을 이해하기 위한 중요한 모형이었습니다, 뿐만 아니라 그들의 상호 작용. 이 모델은 외상 후 또는 수술 후 사건을 모방, 있는 박테리아는 부상 하는 동안 눈에 소개. 본 모델은 매우 재현가능하며 실험요법을 테스트하고치료 기준 1,6,19,29,30의개선을 위한 데이터를 제공하는 데 유용하다. 다른 많은 감염 모델과 마찬가지로,이 모델은 감염의 많은 매개 변수의 독립적 인 제어를 허용하고 감염 결과의 효율적이고 재현 가능한 검사를 가능하게합니다. 지난 수십 년 동안 토끼의 유사한 모델에서 연구는 눈2,4,13,14,31에 B. 세레우스 독성 요인의 효과를 검사했다. B. 세레우스 돌연변이 균주를 주입함으로써 개인 또는 다중 독성 인자가 결여되어 있으며, 이러한 독성 인자의 질병 중증도에 대한 기여는 소독 후의 다른 시간에박테리아의 농도 또는 시각기능(13,14,27,31,32)의손실과 같은 결과에 의해 측정될 수 있다. 또한, 호스트인자는 특정 염증성 숙주 인자(26,29,33,34,35)가부족한 녹아웃 마우스 균주를 감염시킴으로써 본 모델에서 검사되었다. 이 모델은 감염 후 눈에 새로운 화합물을 주입하여이 질병에 대한 잠재적 인 치료를 테스트하는 데유용하다 30,36. 이 원고에서는 B. cereus로마우스 눈을 감염시키고, 감염 후 눈을 수확하고, 내구 세균 부하를 정량화하고, 질병 중증도의 추가 매개 변수를 분석하기 위해 표본을 보존하는 것을 포함하는 상세한 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
강력한 항생제, 항염증제 및 비트레절제술 수술의 가용성에도 불구하고 세균성 내과염은 환자를 눈멀게 할 수 있습니다. 임상 연구는 폐막염을 연구하는 데 유용했습니다. 그러나, 폐염의 실험 모형은 환자를 위한 더 나은 시각적 결과의 결과로 배려의 표준에 있는 진행으로 번역될 수 있는 신속하고 재현가능한 결과를 제공합니다.
마우스 눈의 유리체 부피는 약 7 μL<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 펭 리 박사와 마크 디트마르 (OUHSC P30 라이브 동물 이미징 코어, 딘 A. 맥기 아이 연구소, 오클라호마 시티, OK, 미국)에게 도움을 주셔서 감사합니다. 우리의 연구는 건강의 국가 학회에 의해 지원되었습니다 R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947, 및 R01EY024140. 우리의 연구는 또한 P30EY21725 (살아있는 동물 화상 진찰 및 분석을 위한 NIH CORE 보조금, 분자 생물학 및 세포 화상 진찰)에 의해 지원되었습니다. 우리의 연구는 또한 NEI 비전 과학 전 박사 연수생 프로그램 5T32EY023202, 장로교 건강 재단 연구 지원 보조금 및 실명 방지를 위한 연구에서 딘 A. 맥기 눈 연구소에 무제한 보조금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 2-20 µL pipette | RANIN | L0696003G | NA |
| 37oC Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | NA |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 90003-032 | NA |
| Cell Microinjector | MicroData Instrument, Inc. | PM2000 | NA |
| Fine tip forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-122 | NA |
| Glass beads 1.0 mm | BioSpec | 11079110 | NA |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | NB-I2400 | NA |
| Microcapillary Pipets 5 Microliters | Kimble | 71900-5 | NA |
| Micro-Pipette Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | NA |
| Microscope Axiostar Plus | Zeiss | NA | |
| Microscope OPMI Lumera | Zeiss | NA | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | NA |
| Multichannel pipette 30-300 µL | Biohit | 15626090 | NA |
| Multichannel pipette 5-100 µL | Biohit | 9143724 | NA |
| Needle/Pipette Puller | Kopf | 730 | NA |
| PBS | GIBCO | 1897315 | Molecular grade |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | Molecular grade |
| Reverse action forceps | Katena | K5-8228 | NA |
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