Ovariecancer stamceller (OCSC) er ansvarlige for kræftinitiering, gentagelse, terapeutisk resistens og metastase. OCSC-vaskulær niche anses for at fremme selvfornyelse af OCSC’er, hvilket fører til kemoresistance. Denne protokol danner grundlag for etablering af en reproducerbar OCSC-vaskulær nichemodel in vitro.
Kræftstamceller (CSC’er) befinder sig i en støttende niche, der udgør et mikromiljø bestående af tilstødende stromale celler, kar og ekstracellulær matrix. CSC’ernes evne til at deltage i udviklingen af endotel udgør en vigtig egenskab, der direkte bidrager til den generelle forståelse af mekanismerne for tumorigenese og tumormetastase. Formålet med dette arbejde er at etablere en reproducerbar metode til at undersøge tumorinitieringsevnen hos ovariecancerstamceller (OCSC’er). Heri undersøgte vi neovaskulariseringsmekanismen mellem endotelceller og OCSC’er sammen med de morfologiske ændringer af endotelceller ved hjælp af in vitro-co-kulturmodellen NICO-1. Denne protokol tillader visualisering af neovaskulariseringstrinnet omkring OCSC’erne på en tidsforløbsmåde. Teknikken kan give indsigt i de angiogenetiske egenskaber af OCSC’er i tumormetastase.
Kræft i æggestokkene er den ottende mest almindelige malignitet hos kvinder over hele verden med ca. 300.000 nye diagnoser og anslået 180.000 dødsfald årligt1. Ved den første diagnose præsenterer kræft i æggestokkene ofte med alvorlige symptomer, hvor ca. 75% af patienterne allerede er i fase III-IV. Følgelig er den 5-årige overlevelsesrate <30%, og dødeligheden er den højeste blandt gynækologiske kræftformer2, hvor effektiviteten af behandlingen af kræft i æggestokkene er meget afhængig af kliniske faktorer såsom den vellykkede gennemførelse af debulking-kirurgi, modstand mod kemoterapi og gentagelse efter den indledende behandling.
Ovariecancervæv er hierarkisk organiseret, hvor ikke alle tumorkomponenter er lige i stand til at generere efterkommere. De eneste celler, der er i stand til at forny sig selv og producere en heterogen tumorcellepopulation, anses for at repræsentere kræftstamceller (CSC’er)3. CSC selvfornyelse og tumorinitiering ledsages af fremme af angiogenese for at ombygge deres tumormikromiljø med det formål at opretholde en støttende niche. Tidligere modeller kunne imidlertid ikke anvendes til in vitro-analyser på grund af den begrænsede reproducerbarhed af dyrkning af CSC’er afledt af kliniske prøver på grund af forstyrrelse af sfæroider efter flere passaging. For nylig er eksperimentelle metoder til dyrkning af CSC’er fra patienter blevet udviklet til flere applikationer 4,5,6,7. Især ved at udnytte karakteristikken ved CSC’er til at vokse ved at danne sfæroider i ultralave fastgørelsesplader med serumfrit medium, induceres de dyrkede CSC’er til at udtrykke en stamcelleoverflademarkør, der ikke udtrykkes i normale tumorceller med multilineagedifferentieringspotentiale 8,9.
Nylige data har vist, at persistensen af sovende ovarie (O) CSC’er visualiseret som formidling ved peritoneum er forbundet med deres regenerering som tilbagevendende tumorer10. Forståelse af de molekylære og biologiske egenskaber ved OCSC’er kan således muliggøre effektiv målretning og udryddelse af disse celler, hvilket resulterer i potentiel tumorremission. Især er der lidt kendt om de cellulære og molekylære mekanistiske træk ved CSC’ers roller i angiogenese11. Derfor brugte vi i den nuværende protokol patientafledte OCSC’er i en in vitro-indstilling til at undersøge den angiogene egenskab af endotelceller ved hjælp af co-kulturmodellen, som kan efterligne tumormikromiljøet af CSC’er og endotelceller på det metastatiske sted i den kliniske indstilling. I sidste ende, da neovaskularisering udgør en kritisk proces, der er nødvendig for at understøtte tumorvækst og metastase, vil en bedre forståelse af dens mekanisme muliggøre udviklingen af en ny målretningsterapi til OCSC’er på det metastatiske sted.
Her præsenterer vi en protokol til at visualisere neovaskulariseringstrinnet omkring CSC’erne på en tidsforløbsmåde. Fordelen ved protokollen inkluderer at tillade fuldt reproducerbare undersøgelser ved hjælp af 3D-samkultursystemet, NICO-1, hvilket muliggør observation af virkningerne på patienter af den OCSC-afledte tumorinitieringsevne under endotelcelleangiogenese.
Den præsenterede protokol beskriver, hvordan man efterligner tumormikromiljøet af OCSC’er i en in vitro-indstilling. Den primære komponent i metoden udgør den meget reproducerbare kokulturmodel opnået ved hjælp af NICO-1-systemet, et indirekte Transwell-samkultursystem. Mange af de aktuelt tilgængelige kokulturmodeller undersøger virkningerne af direkte cellecellekontakt på kokulturerede cellepopulationer 12,13,14,15,16,17,18.<sup class="xref"…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af et tilskud til videnskabelig forskning C (bevilling nr. 19K09834 til K.N.) fra Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Kultur, Japan.
0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
15 mL tube | Nunc | 339650 | |
200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
50 mL tube | Corning | 430290 | |
AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
Histodenz | SIGMA | D2158 | |
HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
Y-27632 | WAKO | 253-00513 |