Üç Boyutlu Eş-Kültür Sistemi Kullanılarak Yumurtalık Kanseri Kök Benzeri Hücrelerin Anjiyogenetik Özelliklerinin Değerlendirilmesi, NICO-1
Summary
Yumurtalık kanseri kök hücreleri (OKSK) kanserin başlamasından, nüksetmesinden, terapötik direncinden ve metastazından sorumludur. OCSC vasküler nişinin, OKSC’lerin kendi kendini yenilemesini teşvik ettiği ve kemorezistansa yol açtığı düşünülmektedir. Bu protokol, in vitro olarak tekrarlanabilir bir OCSC vasküler niş model oluşturmak için temel sağlar.
Abstract
Kanser kök hücreleri (CSC’ler), bitişik stromal hücrelerden, damarlardan ve hücre dışı matristen oluşan bir mikro ortam oluşturan destekleyici bir niş içinde bulunur. CSC’lerin endotel gelişimine katılma yeteneği, tümörigenez ve tümör metastazı mekanizmalarının genel olarak anlaşılmasına doğrudan katkıda bulunan önemli bir özellik oluşturmaktadır. Bu çalışmanın amacı, yumurtalık kanseri kök hücrelerinin (OKSK) tümör başlatma yeteneğini araştırmak için tekrarlanabilir bir metodoloji oluşturmaktır. Bu çalışmada, endotel hücreleri ve OKSK’ler arasındaki neovaskülarizasyon mekanizması ve endotel hücrelerinin morfolojik değişiklikleri in vitro ko-kültür modeli NICO-1 kullanılarak incelenmiştir. Bu protokol, OKSK’leri çevreleyen neovaskülarizasyon adımının zaman içinde görüntülenmesini sağlar. Bu teknik, tümör metastazında OKSK’lerin anjiyogenetik özellikleri hakkında fikir verebilir.
Introduction
Yumurtalık kanseri, dünya çapında kadınlarda sekizinci en yaygın malignitedir ve yaklaşık 300.000 yeni tanı ve yılda tahmini 180.000 ölüm1. İlk tanıda, yumurtalık kanseri sıklıkla şiddetli semptomlarla ortaya çıkar ve hastaların yaklaşık% 75’i zaten evre III-IV’tedir. Buna göre, 5 yıllık sağkalım oranı% <30'dur ve mortalite oranı jinekolojik kanserler arasında en yüksektir2, yumurtalık kanseri tedavisinin etkinliği, debulking cerrahisinin başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesi, kemoterapiye direnç ve ilk tedaviden sonra nüks gibi klinik faktörlere büyük ölçüde bağlıdır.
Yumurtalık kanseri dokuları hiyerarşik olarak organize edilmiştir, tüm tümör bileşenleri eşit derecede torunlar üretemez. Kendi kendini yenileyebilen ve heterojen bir tümör hücresi popülasyonu üretebilen tek hücrenin kanser kök hücrelerini (CSC’ler) temsil ettiği düşünülmektedir3. CSC kendini yenileme ve tümör başlangıcına, destekleyici bir niş sağlamak amacıyla tümör mikro çevresini yeniden şekillendirmek için anjiyogenezin teşvik edilmesi eşlik eder. Bununla birlikte, önceki modeller, çoklu pasajdan sonra sferoidlerin bozulması nedeniyle klinik örneklerden türetilen CSC’lerin yetiştirilmesinin sınırlı tekrarlanabilirliği nedeniyle in vitro analizler için kullanılamamıştır. Daha yakın zamanlarda, hastalardan CSC’leri yetiştirmek için deneysel yöntemlerçeşitli uygulamalar için geliştirilmiştir 4,5,6,7. Özellikle, CSC’lerin serumsuz ortama sahip ultra düşük bağlantı plakalarında sferoidler oluşturarak büyüme özelliğinden yararlanarak, ekili CSC’ler, çok soylu farklılaşma potansiyeline sahip normal tümör hücrelerinde eksprese edilmeyen bir kök hücre yüzey belirtecini ifade etmek için uyarılır 8,9.
Son veriler, peritonda yayılım olarak görselleştirilen uykudaki over (O)CSC’lerin kalıcılığının, tekrarlayan tümörler olarak rejenerasyonları ile ilişkili olduğunu göstermiştir10. OCSC’lerin moleküler ve biyolojik özelliklerinin anlaşılması, bu hücrelerin etkili bir şekilde hedeflenmesine ve eradikasyonuna izin verebilir ve bu da potansiyel tümör remisyonuna neden olabilir. Özellikle, CSC’lerin anjiyogenez11’deki rollerinin hücresel ve moleküler mekanik özellikleri hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu nedenle, bu protokolde, klinik ortamda metastatik bölgedeki CSC’lerin ve endotel hücrelerinin tümör mikroortamını taklit edebilen ko-kültür modelini kullanarak endotel hücrelerinin anjiyojenik özelliğini araştırmak için in vitro ortamda hasta kaynaklı OCSC’ler kullandık. Nihayetinde, neovaskülarizasyon, tümör büyümesini ve metastazını desteklemek için gerekli kritik bir süreç oluşturduğundan, mekanizmasının daha iyi anlaşılması, metastatik bölgedeki OKSK’ler için yeni bir hedefleme tedavisinin geliştirilmesine izin verecektir.
Burada, CSC’leri çevreleyen neovaskülarizasyon adımını zaman çizelgesinde görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Protokolün avantajı, 3D ko-kültür sistemi NICO-1 kullanılarak tamamen tekrarlanabilir araştırmalara izin vermeyi içerir, böylece endotel hücre anjiyogenezi sırasında OKSC kaynaklı tümör başlatma yeteneğinin hastalar üzerindeki etkilerinin gözlemlenmesine izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan protokol, OCSC’lerin tümör mikroçevresinin in vitro bir ortamda nasıl taklit edileceğini açıklamaktadır. Yöntemin birincil bileşeni, dolaylı bir Transwell ortak kültür sistemi olan NICO-1 sistemi kullanılarak elde edilen yüksek oranda tekrarlanabilir kokültür modelini oluşturur. Şu anda mevcut olan kokültür modellerinin çoğu, doğrudan hücre-hücre temasının kokültürlenmiş hücre popülasyonları üzerindeki etkilerini incelemektedir 12,13,14,15,16,17,18.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Japonya Eğitim, Bilim ve Kültür Bakanlığı’ndan Bilimsel Araştırma C (K.N.’ye hibe no. 19K09834) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.025% Trypsin | Thermo | R001100 | |
| 10 mL Pipet | Thermo | 170356N | |
| 1250 µL Pipet tip | QSP | T112XLRS-Q | |
| 15 mL tube | Nunc | 339650 | |
| 200 µL Pipet tip | QSP | T110RS-NEW | |
| 2-Mercaptoethanol | Thermo (Gibco) | 21985023 | |
| 5 mL Pipet | Thermo | 170366N | |
| 50 mL tube | Corning | 430290 | |
| AccuMAX | Innovative Cell Technologies | AM105 | |
| BioCoatTM Collagen I 60mm Dish | Corning | 356401 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Costar 6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | |
| Ethanol | WAKO | 057-00456 | |
| FGF-Basic | Thermo (Gibco) | PHG0021 | |
| Histodenz | SIGMA | D2158 | |
| HUEhT-1 cell | JCRB Cell Bank | JCRB1458 | |
| ICCP Filter 0.6 µm | Ginrei Lab. | 2525-06 | |
| Insulin, human | SIGMA (Roche) | 11376497001 | |
| Luminometer | PerkinElmer | ARVO MX-flad | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356234 | |
| Microscope | Yokogawa | CQ-1 | |
| NICO-1 | Ginrei Lab. | 2501-02 | |
| OptiPlate-96 | PerkinElmer | 6005290 | |
| P1000 Pipet | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipet | Gilson | F123601 | |
| PBS | Thermo (Gibco) | 14190-144 | |
| StemPro hESC SFM | Thermo (Gibco) | A1000701 | |
| Transfer Pipet | FALCON | 357575 | |
| Y-27632 | WAKO | 253-00513 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA, a Cancer Journal for Clinicians. 68, 394-424 (2018).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Lytle, N. K., Barber, A. G., Reya, T. Stem cell fate in cancer growth, progression and therapy resistance. Nature Reviews Cancer. 18 (11), 669-680 (2018).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes and Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Lonardo, E., et al. Nodal/Activin signaling drives selfrenewal and tumorigenicity of pancreatic cancer stem cells and provides a target for combined drug therapy. Cell Stem Cell. 9 (5), 433-446 (2011).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
- Ohata, H., et al. Induction of the stem-like cell regulator CD44 by Rho kinase inhibition contributes to the maintenance of colon cancer-initiating cells. 암 연구학. 72 (19), 5101-5110 (2012).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and characterization of an in vitro model of ovarian cancer stem-like cells with an enhanced proliferative capacity. 암 연구학. 76 (1), 150-160 (2016).
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. 암 연구학. 63 (18), 5821-5828 (2003).
- Zong, X., Nephew, K. P. Ovarian cancer stem cells: role in metastasis and opportunity for therapeutic targeting. Cancers (Basel). 11 (7), 934 (2019).
- Lizárraga-Verdugo, E., et al. Cancer stem cells and its role in angiogenesis and vasculogenic mimicry in gastrointestinal cancers. Frontiers in oncology. 10, 413 (2020).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Richardson, S. M., et al. Intervertebral disc cell-mediated mesenchymal stem cell differentiation. Stem Cells. 24 (3), 707-716 (2006).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (5), 1622-1631 (2008).
- Sheng, H., et al. A critical role of IFN-gamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Research. 18 (8), 846-857 (2008).
- Csaki, C., Matis, U., Mobasheri, A., Shakibaei, M. Co-culture of canine mesenchymal stem cells with primary bone-derived osteoblasts promotes osteogenic differentiation. Histochemistry and Cell Biology. 131 (2), 251-266 (2009).
- Aguirre, A., Planell, J. A., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Proffen, B. L., Haslauer, C. M., Harris, C. E., Murray, M. M. Mesenchymal stem cells from the retropatellar fat pad and peripheral blood stimulate ACL fibroblast migration, proliferation, and collagen gene expression. Connective Tissue Research. 54 (1), 14-21 (2013).
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society & Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 17, 457-474 (2017).
- Burger, R., et al. Incorporation of bevacizumab in the primary treatment of ovarian cancer. New England Journal of Medicine. 365, 2473-2483 (2011).
- Goel, H., Mercurio, A. VEGF targets the tumour cell. Nature Reviews Cancer. 13, 871-882 (2013).
- Yu, L., et al. Interaction between bevacizumab and murine VEGF-A: a reassessment. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (2), 522-527 (2008).
