Stamcellsbaserad terapi har dykt upp som en effektiv strategi för att reparera skadade hjärtvävnader efter hjärtinfarkt. Vi erbjuder en optimal in vivo-applikation för stamcellstransplantation med gelatinhydränglar som kan vara enzymatiskt korslänkade.
En av de stora problem som står inför nuvarande hjärt stamcellsterapier för att förhindra postinfarct hjärtsvikt är den låga retention och överlevnaden av transplanterade celler inom det skadade hjärtmuskeln, vilket begränsar deras terapeutiska effekt. Nyligen har användningen av byggnadsställningar biomaterial fått uppmärksamhet för att förbättra och maximera stamcellsterapi. Syftet med detta protokoll är att införa en enkel och enkel teknik för transplantation av benmärgsbaserade mesenkymala stamceller (MSC) med hjälp av injicerbara hydroxyfenylpropionsyra (GH) hydrogeler; hydrogelerna är gynnsamma som cellleveransplattform för hjärtvävnadstekniska applikationer på grund av deras förmåga att vara korslänkade på plats och hög biokompatibilitet. Vi presenterar en enkel metod för att tillverka MSC-lastning GH hydrogeler (MSC/hydrogels) och utvärdera deras överlevnad och spridning i tredimensionella (3D) in vitro kultur. Dessutom visar vi en teknik för intramyocardial transplantation av MSC/hydrogels hos möss, beskriver ett kirurgiskt ingrepp för att inducera hjärtinfarkt (MI) via vänster främre fallande (LAD) födans gatan ligatur och efterföljande MSC/hydrogels transplantation.
Hjärt stamcellsterapi har dykt upp som ett potentiellt tillvägagångssätt för skador reparation och regenerering1,2. Trots de senaste positiva resultaten i djurmodeller och kliniska prövningar är tillämpningen av stamcellsbaserad behandling för hjärtinfarkt begränsad på grund av låg retention och dålig överlevnad av injicerade celler vid de infarkterade hjärtvävnaderna3,4. Som ett resultat har användningen av cellbaserad vävnadsteknik, inklusive injicerbara biomaterial5, hjärtplåster6, och cellark7, studerats intensivt för att förbättra cellretention och integration inom värdmuskeln.
Bland de olika potentiella metoderna för bioengineered hjärtvävnad reparation, injicerbara hydrogeler i kombination med lämpliga celltyper, såsom mesenchymala stamceller (MSCs), embryonala stamceller (EIC) och inducerad pluripotenta stamceller (iPSCs), är ett attraktivt alternativ att effektivt leverera celler till myokardregioner8,9. Gelatin, en välkänd naturlig polymer, kan användas som en injicerbar matris på grund av dess stora biokompatibilitet, betydande biologisk nedbrytbarhet och minskad immunogenicitet jämfört med ett brett spektrum av biomaterial som används i biomedicinska tillämpningar. Även om gelatinbaserade injicerbara plattformar har stor potential, är deras tillämplighet in vivo fortfarande begränsad baserat på deras låga mekaniska styvhet och enkla nedbrytbarhet i den fysiologiska miljön.
För att övervinna dessa begränsningar har en ny och enkel design av gelatinbaserade hydrogeler bestående av hydroxyfenylpropionsyra föreslagits för in vivo-applikationer. Gelatinhydroxifenylpropionsyra (GH) konjugat kan korslänkas på plats i närvaro av ett enzym, pepparrotsperoxidas (HRP), och därefter kapsla in olika läkemedel, biomolekyler eller celler i hydrogelen, vilket tyder på stor potential i vävnadstekniskaapplikationer 10,11,12,13,14. Dessutom har vi nyligen undersökt de terapeutiska effekterna av GH hydrogeler som innehåller inkapslade MSCs och visat deras användning i framgångsrika hjärt reparation och regenerering efter MI i en murin modell15. I detta protokoll beskriver vi en enkel teknik för inkapsling och in vitro tredimensionell (3D) spridning av MSCs inom GH hydrogels. Vi introducerar också ett kirurgiskt ingrepp utformat för att generera en murin MI-modell via kranskärlens ligatur och intramyocardial transplantation av MSC-ladda GH hydrogeler i det infarcted hjärtat.
Injicerbara GH-hydrogeler har stor potential för in vivo-applikationer på grund av deras förmåga att homogent införliva olika terapeutiska medel på plats. Dessutom kan deras fysiska och biokemiska egenskaper lätt manipuleras baserat på sjukdomsberoende krav. I detta avseende har injicerbara hydrogeler föreslagits för att ta itu med de stora begränsningarna i nuvarande hjärt stamcellsterapi hämmas av dålig överlevnad och cellretention (dvs. < 10% inom 24 h efter transplantation) i det skadade hjärtat<sup c…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöds av Grundforskningsprogrammet genom Koreas nationella forskningsstiftelse (NRF) finansierad av utbildningsministeriet (NRF-2018R1D1A1A02049346)
4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
DMEM | Gibco | 11995-065 | |
DPBS | Gibco | 14040-133 | |
Dual-syringe | |||
EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
FBS | Gibco | 16000-044 | |
Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
Forcep | HEBU | HB0458 | |
Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
Iodine | Green Pharmaceutical | ||
LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
Slide scanner | Leica | SCN400 | |
Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |