Трансплантация внутримякардных инъекций MSC-Loading инъекционных гидрогелей после инфаркта миокарда в модели Murine
Summary
Терапия на основе стволовых клеток стала эффективной стратегией восстановления поврежденных сердечных тканей после инфаркта миокарда. Мы обеспечиваем оптимальное применение in vivo для трансплантации стволовых клеток с использованием желатиновых гидрогелей, которые могут быть энзиматично взаимосвязаны.
Abstract
Одной из основных проблем, стоящих перед текущей сердечной терапии стволовыми клетками для предотвращения постинфарктной сердечной недостаточности является низкая задержка и выживаемость пересаженных клеток в рамках травмированного миокарда, ограничивая их терапевтическую эффективность. В последнее время использование строительных биоматериалов привлекло внимание к улучшению и максимизации терапии стволовыми клетками. Цель этого протокола заключается в внедрении простого и простого метода трансплантации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (MSCs) с использованием инъекционных гидроксифенилпионовой кислоты (GH) гидрогелов; гидрогели являются благоприятными в качестве платформы доставки клеток для сердечной ткани инженерных приложений из-за их способности быть взаимосвязаны на месте и высокой биосовместимости. Мы представляем простой метод для изготовления MSC-загрузки гидрогели GH (MSC/гидрогели) и оценки их выживания и распространения в трехмерной (3D) культуре in vitro. Кроме того, мы демонстрируем методику внутримиокардной трансплантации MSC/гидрогели у мышей, описывающую хирургическую процедуру для индуцирования инфаркта миокарда (МИ) через перевязку коронарной артерии левой передней части (LAD) и последующую трансплантацию MSC/hydrogels.
Introduction
Терапия стволовыми клетками сердца стала потенциальным подходом к ремонту и регенерации миокарда1,2. Несмотря на недавние положительные результаты в животных моделях и клинических испытаниях, применение терапии на основе стволовых клеток для восстановления миокарда ограничено из-за низкого удержания и плохого выживания инъекционных клеток в инфарктных тканяхсердца 3,4. В результате, использование клеточной инженерии тканей, в том числе инъекционныхбиоматериалов 5,сердечные пятна 6, иклеточные листы 7, был интенсивно изучен для улучшения удержания клеток и интеграции в принимающей миокарда.
Среди различных потенциальных подходов к биоинженерной сердечной ткани ремонт, инъекционные гидрогели в сочетании с соответствующими типами клеток, таких как мезенхимальные стволовые клетки (MSCs), эмбриональных стволовых клеток (ESCs), и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), являются привлекательным вариантом для эффективной доставки клеток в миокардарегионах 8,9. Gelatin, известный натуральный полимер, может быть использован в качестве инъекционной матрицы из-за его большой биосовместимости, значительной биоразлагаемости и снижения иммуногенности по сравнению с широким спектром биоматериалов, используемых в биомедицинских приложениях. Хотя инъекционные платформы на основе желатина имеют большой потенциал, их применимость in vivo остается ограниченной в зависимости от их низкой механической жесткости и легкой деградируемости в физиологической среде.
Для преодоления этих ограничений для применения in vivo была предложена новая и простая конструкция гидрогеля на основе желатина, состоящего из гидроксифенил-пропионовой кислоты. Конъюгирует желатин-гидроксифенил пропионовая кислота (GH) может быть взаимосвязана на месте в присутствии фермента, пероксидазы хрена (HRP), а затем инкапсулировать различные препараты, биомолекулы, или клетки в гидрогеле, предлагая большой потенциал вобласти тканевой инженерии приложений 10,11,12,13,14. Кроме того, мы недавно исследовали терапевтические эффекты гидрогели GH, содержащие инкапсулированные MSCs и продемонстрировали их использование в успешном ремонте сердца и регенерации после MI в моделиmurine 15. В этом протоколе мы описываем простой метод инкапсуляции и трехмерного (3D) распространения ПМС в гидрогелях GH. Мы также вводим хирургическую процедуру, предназначенную для генерации модели murine MI с помощью перевязки коронарных артерий и внутримиокардной трансплантации гидрогеля MSC-загрузки GH в инфарктное сердце.
Protocol
Representative Results
Discussion
Инъекционные гидрогели GH имеют большой потенциал для in vivo приложений из-за их способности однородно включать различные терапевтические агенты на месте. Кроме того, их физическими и биохимическими свойствами можно легко манипулировать на основе потребностей, зависящих от болезней. В э…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование поддерживается Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемый Министерством образования (NRF-2018R1D1A1A02049346)
Materials
| 4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| 5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
| 8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
| 8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
| Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
| Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
| Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| DPBS | Gibco | 14040-133 | |
| Dual-syringe | |||
| EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
| Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
| Forcep | HEBU | HB0458 | |
| Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
| Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
| 50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
| Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
| Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
| Iodine | Green Pharmaceutical | ||
| LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
| Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
| Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
| Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
| HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
| PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
| Slide scanner | Leica | SCN400 | |
| Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
| Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
| Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
| Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |
References
- Jhund, P. S., McMurray, J. J. Heart failure after acute myocardial infarction: a lost battle in the war on heart failure. Circulation. 118 (20), 2019-2021 (2008).
- Cahill, T. J., Kharbanda, R. K. Heart failure after myocardial infarction in the era of primary percutaneous coronary intervention: Mechanisms, incidence and identification of patients at risk. World Journal of Cardiology. 9 (5), 407-415 (2017).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. npj Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018, 1909346 (2018).
- Alagarsamy, K. N., Yan, W., Srivastava, A., Desiderio, V., Dhingra, S. Application of injectable hydrogels for cardiac stem cell therapy and tissue engineering. Reviews in Cardiovascular Medicine. 20 (4), 221-230 (2019).
- Gaetani, R., et al. Epicardial application of cardiac progenitor cells in a 3D-printed gelatin/hyaluronic acid patch preserves cardiac function after myocardial infarction. Biomaterials. 61, 339-348 (2015).
- Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circualtion Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).
- Hasan, A., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Repair after Myocardial Infarction. Advanced Science. 2 (11), 1500122 (2015).
- Wu, R., Hu, X., Wang, J. Concise Review: Optimized Strategies for Stem Cell-Based Therapy in Myocardial Repair: Clinical Translatability and Potential Limitation. Stem Cells. 36 (4), 482-500 (2018).
- Lee, Y., et al. In situ forming gelatin-based tissue adhesives and their phenolic content-driven properties. Journal of Materials Chemistry B. 1 (18), 2407-2414 (2013).
- Lee, Y., Bae, J. W., Lee, J. W., Suh, W., Park, K. D. Enzyme-catalyzed in situ forming gelatin hydrogels as bioactive wound dressings: effects of fibroblast delivery on wound healing efficacy. Journal of Materials Chemistry B. 2 (44), 7712-7718 (2014).
- Lee, S. H., et al. In situ Crosslinkable Gelatin Hydrogels for Vasculogenic Induction and Delivery of Mesenchymal Stem Cells. Advanced Functional Materials. 24 (43), 6771-6781 (2014).
- Jung, B. K., et al. A hydrogel matrix prolongs persistence and promotes specific localization of an oncolytic adenovirus in a tumor by restricting nonspecific shedding and an antiviral immune response. Biomaterials. 147, 26-38 (2017).
- Kim, G., et al. Tonsil-derived mesenchymal stem cell-embedded in situ crosslinkable gelatin hydrogel therapy recovers postmenopausal osteoporosis through bone regeneration. PLoS One. 13 (7), 0200111 (2018).
- Kim, C. W., et al. MSC-Encapsulating in situ Cross-Linkable Gelatin Hydrogels To Promote Myocardial Repair. ACS Applied Bio Materials. 3 (3), 1646-1655 (2020).
- Meirelles Lda, S., Nardi, N. B. Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization. Br J Haematol. 123 (4), 702-711 (2003).
- Ojha, N., et al. Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), 2435-2443 (2008).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. Journal of Applied Physiology. 102 (6), 2104-2111 (2007).
- Terrovitis, J., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. Journal of the American College of Cardiology. 54 (17), 1619-1626 (2009).
- Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell Therapy for Cardiovascular Disease: A Comparison of Methods of Delivery. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (2), 177-181 (2011).
