La terapia basada en células madre ha surgido como una estrategia eficiente para reparar los tejidos cardíacos lesionados después del infarto de miocardio. Proporcionamos una aplicación in vivo óptima para el trasplante de células madre utilizando hidrogeles de gelatina que son capaces de ser enzimáticamente cruzados.
Uno de los principales problemas a los que se enfrentan las terapias actuales de células madre cardíacas para prevenir la insuficiencia cardíaca postinfarto es la baja retención y las tasas de supervivencia de las células trasplantadas dentro del miocardio lesionado, limitando su eficacia terapéutica. Recientemente, el uso de biomateriales de andamios ha ganado atención para mejorar y maximizar la terapia con células madre. El objetivo de este protocolo es introducir una técnica simple y directa para trasplantar células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (MSC) utilizando hidrogeles de ácido propionico hidroxifenilo inyectable (GH); los hidrogeles son favorables como plataforma de administración celular para aplicaciones de ingeniería de tejidos cardíacos debido a su capacidad de estar intercontrados in situ y alta biocompatibilidad. Presentamos un método sencillo para fabricar hidrogeles GH (MSC/hidrogeles) que cargan MSC y evaluar su supervivencia y proliferación en cultivo in vitro tridimensional (3D). Además, demostramos una técnica para el trasplante intramiocardial de MSC/hidrogeles en ratones, describiendo un procedimiento quirúrgico para inducir infarto de miocardio (MI) a través de ligadura arterial coronaria de descenso anterior (LAD) izquierda y posterior trasplante de MSC/hidrogeles.
La terapia con células madre cardíacas ha surgido como un enfoque potencial para la reparación y regeneración de miocárdica1,2. A pesar de los recientes resultados positivos en modelos animales y ensayos clínicos, la aplicación de terapia basada en células madre para la reparación de miocardio es limitada debido a la baja retención y la mala supervivencia de las células inyectadas en los tejidos cardíacos infartos3,4. Como resultado, el uso de ingeniería de tejidos a base de células, incluyendo biomateriales inyectables5,parches cardíacos6,y hojas celulares7, se ha estudiado intensamente para mejorar la retención celular y la integración dentro del miocardio huésped.
Entre los diversos enfoques potenciales para la reparación de tejidos cardíacos bioingenieros, los hidrogeles inyectables combinados con tipos celulares apropiados, como las células madre mesenquimales (MSC), las células madre embrionarias (ESC) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC), son una opción atractiva para entregar eficazmente células en las regiones miocárdicas8,9. La gelatina, un polímero natural bien conocido, se puede utilizar como una matriz inyectable debido a su gran biocompatibilidad, biodegradabilidad considerable e inmunogenicidad reducida en comparación con una amplia gama de biomateriales utilizados en aplicaciones biomédicas. Aunque las plataformas inyectables a base de gelatina tienen un gran potencial, su aplicabilidad in vivo sigue siendo limitada en función de su baja rigidez mecánica y fácil degradabilidad en el entorno fisiológico.
Para superar estas limitaciones, se ha propuesto un diseño novedoso y sencillo de hidrogeles a base de gelatina que consisten en ácido propionico hidroxifenilo para aplicaciones in vivo. Los conjugados de ácido propionico gelatinoso-hidroxifenilo (GH) se pueden cruzar in situ en presencia de una enzima, peroxidasa rábano picante (HRP), y posteriormente encapsular varios fármacos, biomoléculas o células dentro del hidrogel, lo que sugiere un gran potencial en aplicaciones de ingeniería de tejidos10,11,12,13,14. Además, recientemente hemos investigado los efectos terapéuticos de los hidrogeles GH que contienen MSC encapsulados y hemos demostrado su uso en la reparación y regeneración cardíaca exitosa después de la MI en un modelo murino15. En este protocolo, describimos una técnica simple para la encapsulación y proliferación in vitro tridimensional (3D) de MSC dentro de los hidrogeles GH. También presentamos un procedimiento quirúrgico diseñado para generar un modelo de MI murino a través de ligadura de arteria coronaria y trasplante intramiocardial de hidrogeles GH de carga DE MSC en el corazón infarto.
Los hidrogeles GH inyectables tienen un gran potencial para aplicaciones in vivo debido a su capacidad para incorporar homogéneamente diversos agentes terapéuticos in situ. Además, sus propiedades físicas y bioquímicas se pueden manipular fácilmente en función de los requisitos dependientes de la enfermedad. En este sentido, se han propuesto hidrogeles inyectables para hacer frente a las principales limitaciones en la terapia actual de células madre cardíacas obstaculizadas por la mala supervivencia y retención…
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación cuenta con el apoyo del Programa de Investigación en Ciencias Básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Educación (NRF-2018R1D1A1A02049346)
4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
DMEM | Gibco | 11995-065 | |
DPBS | Gibco | 14040-133 | |
Dual-syringe | |||
EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
FBS | Gibco | 16000-044 | |
Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
Forcep | HEBU | HB0458 | |
Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
Iodine | Green Pharmaceutical | ||
LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
Slide scanner | Leica | SCN400 | |
Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |