Intramyocardial Transplantation av MSC-loading injicerbara hydrogeler efter hjärtinfarkt i en Murine Modell
Summary
Stamcellsbaserad terapi har dykt upp som en effektiv strategi för att reparera skadade hjärtvävnader efter hjärtinfarkt. Vi erbjuder en optimal in vivo-applikation för stamcellstransplantation med gelatinhydränglar som kan vara enzymatiskt korslänkade.
Abstract
En av de stora problem som står inför nuvarande hjärt stamcellsterapier för att förhindra postinfarct hjärtsvikt är den låga retention och överlevnaden av transplanterade celler inom det skadade hjärtmuskeln, vilket begränsar deras terapeutiska effekt. Nyligen har användningen av byggnadsställningar biomaterial fått uppmärksamhet för att förbättra och maximera stamcellsterapi. Syftet med detta protokoll är att införa en enkel och enkel teknik för transplantation av benmärgsbaserade mesenkymala stamceller (MSC) med hjälp av injicerbara hydroxyfenylpropionsyra (GH) hydrogeler; hydrogelerna är gynnsamma som cellleveransplattform för hjärtvävnadstekniska applikationer på grund av deras förmåga att vara korslänkade på plats och hög biokompatibilitet. Vi presenterar en enkel metod för att tillverka MSC-lastning GH hydrogeler (MSC/hydrogels) och utvärdera deras överlevnad och spridning i tredimensionella (3D) in vitro kultur. Dessutom visar vi en teknik för intramyocardial transplantation av MSC/hydrogels hos möss, beskriver ett kirurgiskt ingrepp för att inducera hjärtinfarkt (MI) via vänster främre fallande (LAD) födans gatan ligatur och efterföljande MSC/hydrogels transplantation.
Introduction
Hjärt stamcellsterapi har dykt upp som ett potentiellt tillvägagångssätt för skador reparation och regenerering1,2. Trots de senaste positiva resultaten i djurmodeller och kliniska prövningar är tillämpningen av stamcellsbaserad behandling för hjärtinfarkt begränsad på grund av låg retention och dålig överlevnad av injicerade celler vid de infarkterade hjärtvävnaderna3,4. Som ett resultat har användningen av cellbaserad vävnadsteknik, inklusive injicerbara biomaterial5, hjärtplåster6, och cellark7, studerats intensivt för att förbättra cellretention och integration inom värdmuskeln.
Bland de olika potentiella metoderna för bioengineered hjärtvävnad reparation, injicerbara hydrogeler i kombination med lämpliga celltyper, såsom mesenchymala stamceller (MSCs), embryonala stamceller (EIC) och inducerad pluripotenta stamceller (iPSCs), är ett attraktivt alternativ att effektivt leverera celler till myokardregioner8,9. Gelatin, en välkänd naturlig polymer, kan användas som en injicerbar matris på grund av dess stora biokompatibilitet, betydande biologisk nedbrytbarhet och minskad immunogenicitet jämfört med ett brett spektrum av biomaterial som används i biomedicinska tillämpningar. Även om gelatinbaserade injicerbara plattformar har stor potential, är deras tillämplighet in vivo fortfarande begränsad baserat på deras låga mekaniska styvhet och enkla nedbrytbarhet i den fysiologiska miljön.
För att övervinna dessa begränsningar har en ny och enkel design av gelatinbaserade hydrogeler bestående av hydroxyfenylpropionsyra föreslagits för in vivo-applikationer. Gelatinhydroxifenylpropionsyra (GH) konjugat kan korslänkas på plats i närvaro av ett enzym, pepparrotsperoxidas (HRP), och därefter kapsla in olika läkemedel, biomolekyler eller celler i hydrogelen, vilket tyder på stor potential i vävnadstekniskaapplikationer 10,11,12,13,14. Dessutom har vi nyligen undersökt de terapeutiska effekterna av GH hydrogeler som innehåller inkapslade MSCs och visat deras användning i framgångsrika hjärt reparation och regenerering efter MI i en murin modell15. I detta protokoll beskriver vi en enkel teknik för inkapsling och in vitro tredimensionell (3D) spridning av MSCs inom GH hydrogels. Vi introducerar också ett kirurgiskt ingrepp utformat för att generera en murin MI-modell via kranskärlens ligatur och intramyocardial transplantation av MSC-ladda GH hydrogeler i det infarcted hjärtat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Injicerbara GH-hydrogeler har stor potential för in vivo-applikationer på grund av deras förmåga att homogent införliva olika terapeutiska medel på plats. Dessutom kan deras fysiska och biokemiska egenskaper lätt manipuleras baserat på sjukdomsberoende krav. I detta avseende har injicerbara hydrogeler föreslagits för att ta itu med de stora begränsningarna i nuvarande hjärt stamcellsterapi hämmas av dålig överlevnad och cellretention (dvs. < 10% inom 24 h efter transplantation) i det skadade hjärtat<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av Grundforskningsprogrammet genom Koreas nationella forskningsstiftelse (NRF) finansierad av utbildningsministeriet (NRF-2018R1D1A1A02049346)
Materials
| 4 % paraformaldehyde (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| 5-0 silk suture | AILEE | SK534 | |
| 8-0 polypropylene suture | ETHICON | M8732H | |
| 8-well chamber slide | Nunc LAB-TEK | 154534 | |
| Angiocath Plus (22GA) catheter | BD Angiocath Plus | REF382423 | |
| Antibiotic-antimyocotic | Gibco | 15240-062 | |
| Centrifuge | GYROGEN | 1582MGR | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Cover slipe | MARIENFELD | 101242 | |
| Deluxe High Temperature Cautery kit | Bovie | QTY1 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | |
| DPBS | Gibco | 14040-133 | |
| Dual-syringe | |||
| EOSIN | SIGMA-ALDRICH | HT110116 | |
| Ethanol | EMSURE | K49350783 739 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISISON INSTRUMENTS | WP1820 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I (FITC) | SIGMA-ALDRICH | F7250 | |
| Forcep | HEBU | HB0458 | |
| Hair removal cream | Ildong Pharmaceutical | ||
| Heating pad | Stoelting | 50300 | Homeothermic Blanket System |
| 50301 | Replacement Heating Pad for 50300 (10 X 12.5cm) | ||
| Hematoxylin | SIGMA-ALDRICH | HHS80 | |
| Horseradish peroxide (HRP; 250-330 U/mg) | SIGMA-ALDRICH | P8375 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2; 30 wt % in H2O) | SIGMA-ALDRICH | 216763 | |
| Iodine | Green Pharmaceutical | ||
| LIVE/DEAD cell staining kit | Thermo Fisher | R37601 | |
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | ||
| Micro centrifuge | HANIL | Micro 12 | |
| Micro needle holder | KASCO | 37-1452 | |
| Micro scissor | HEBU | HB7381 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| MT staining kit | SIGMA-ALDRICH | HT1079-1SET | Weigert’s iron hematoxylin solution |
| HT15-1KT | Trichrome Stain (Masson) Kit | ||
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS buffer | Gibco | 10010-023 | |
| PHK26 staining kit | SIGMA-ALDRICH | MINI26 | |
| Slide scanner | Leica | SCN400 | |
| Surgical scissor | HEBU | HB7454 | |
| Surgical tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Tissue cassette | Scilab Korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Trout-Barraquer needle holder curved | KASCO | 50-3710c | |
| Ultrasound system | Philips | Affiniti 50 | |
| Xylene | JUNSEI | 25175-0430 |
References
- Jhund, P. S., McMurray, J. J. Heart failure after acute myocardial infarction: a lost battle in the war on heart failure. Circulation. 118 (20), 2019-2021 (2008).
- Cahill, T. J., Kharbanda, R. K. Heart failure after myocardial infarction in the era of primary percutaneous coronary intervention: Mechanisms, incidence and identification of patients at risk. World Journal of Cardiology. 9 (5), 407-415 (2017).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. npj Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018, 1909346 (2018).
- Alagarsamy, K. N., Yan, W., Srivastava, A., Desiderio, V., Dhingra, S. Application of injectable hydrogels for cardiac stem cell therapy and tissue engineering. Reviews in Cardiovascular Medicine. 20 (4), 221-230 (2019).
- Gaetani, R., et al. Epicardial application of cardiac progenitor cells in a 3D-printed gelatin/hyaluronic acid patch preserves cardiac function after myocardial infarction. Biomaterials. 61, 339-348 (2015).
- Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circualtion Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).
- Hasan, A., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Repair after Myocardial Infarction. Advanced Science. 2 (11), 1500122 (2015).
- Wu, R., Hu, X., Wang, J. Concise Review: Optimized Strategies for Stem Cell-Based Therapy in Myocardial Repair: Clinical Translatability and Potential Limitation. Stem Cells. 36 (4), 482-500 (2018).
- Lee, Y., et al. In situ forming gelatin-based tissue adhesives and their phenolic content-driven properties. Journal of Materials Chemistry B. 1 (18), 2407-2414 (2013).
- Lee, Y., Bae, J. W., Lee, J. W., Suh, W., Park, K. D. Enzyme-catalyzed in situ forming gelatin hydrogels as bioactive wound dressings: effects of fibroblast delivery on wound healing efficacy. Journal of Materials Chemistry B. 2 (44), 7712-7718 (2014).
- Lee, S. H., et al. In situ Crosslinkable Gelatin Hydrogels for Vasculogenic Induction and Delivery of Mesenchymal Stem Cells. Advanced Functional Materials. 24 (43), 6771-6781 (2014).
- Jung, B. K., et al. A hydrogel matrix prolongs persistence and promotes specific localization of an oncolytic adenovirus in a tumor by restricting nonspecific shedding and an antiviral immune response. Biomaterials. 147, 26-38 (2017).
- Kim, G., et al. Tonsil-derived mesenchymal stem cell-embedded in situ crosslinkable gelatin hydrogel therapy recovers postmenopausal osteoporosis through bone regeneration. PLoS One. 13 (7), 0200111 (2018).
- Kim, C. W., et al. MSC-Encapsulating in situ Cross-Linkable Gelatin Hydrogels To Promote Myocardial Repair. ACS Applied Bio Materials. 3 (3), 1646-1655 (2020).
- Meirelles Lda, S., Nardi, N. B. Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization. Br J Haematol. 123 (4), 702-711 (2003).
- Ojha, N., et al. Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), 2435-2443 (2008).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. Journal of Applied Physiology. 102 (6), 2104-2111 (2007).
- Terrovitis, J., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. Journal of the American College of Cardiology. 54 (17), 1619-1626 (2009).
- Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell Therapy for Cardiovascular Disease: A Comparison of Methods of Delivery. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (2), 177-181 (2011).
