Her præsenterer vi en protokol til at karakterisere den komplette biomolekylære korona, proteiner og metabolitter, erhvervet af nanomaterialer fra biofluider ved hjælp af en kapillær elektroforese – massespektrometri tilgang.
Adsorptionen af biomolekyler fra omgivende biologiske matricer til overfladen af nanomaterialer (NMs) for at danne koronaen har været af interesse i det sidste årti. Interessen for bio-nano-grænsefladen skyldes, at den biomolekylære korona giver NMs en biologisk identitet og dermed får kroppen til at identificere dem som “selv”. For eksempel har tidligere undersøgelser vist, at proteinerne i koronaen er i stand til at interagere med membranreceptorer for at påvirke cellulær optagelse og fastslået, at koronaen er ansvarlig for cellulær handel med NMs og deres eventuelle toksicitet. Til dato har de fleste undersøgelser fokuseret på protein-corona og overset de mulige virkninger af metabolitterne, der indgår i koronaen eller synergieffekterne mellem komponenter i den komplette biomolekylære korona. Som sådan demonstrerer dette arbejde metoder til at karakterisere både protein- og metabolitkomponenterne i den biomolekylære korona ved hjælp af bottom-up proteomics og metabolomics tilgange parallelt. Dette omfatter en on-partikel fordøje af proteinet korona med et overfladeaktivt middel, der anvendes til at øge protein opsving, og en passiv karakterisering af metabolit korona ved at analysere metabolit matricer før og efter NM engagementer. Dette arbejde introducerer kapillær elektroforese – massespektrometri (CESI-MS) som en ny teknik til NM koronakarakterisering. De protokoller, der er skitseret her, viser, hvordan CESI-MS kan bruges til pålidelig karakterisering af både protein og metabolit corona erhvervet af NMs. Overgangen til CESI-MS reducerer i høj grad den krævede prøvemængde (sammenlignet med traditionel væskekromatografi – massespektrometri (LC-MS) tilgange) med flere injektioner muligt fra så lidt som 5 μL prøve, hvilket gør det ideelt til volumenbegrænsede prøver. Desuden reduceres de miljømæssige konsekvenser af analysen med hensyn til LC-MS på grund af de lave strømningshastigheder (<20 nL/min) i CESI-MS og brugen af vandige elektrolytter, som eliminerer behovet for organiske opløsningsmidler.
Bio-nano-interaktioner på grænsefladen mellem nanomaterialer (NM) overflader og biologiske matricer, hvorfra biomolekyler adsorberes til NM, er et intenst forskningsområde, der understøtter nanosikkerhed og nanomedicin1. Dette lag af adsorberet biomolekyler giver NMs en biologisk identitet, således at celler identificerer dem som “selv”, der efterfølgende påvirker cellulær optagelse, distribution og biologiske slutpunkter2,3,4. Langt de fleste bio-nano undersøgelser har fokuseret på proteinerne i koronaen, og har vist, at proteiner varierer kvantitativt og kvalitativt mellem NMs af forskellige sammensætninger5. Denne variation afhænger både af NM’s egenskaber, såsom størrelse, funktionalisering og materiale ud over egenskaberne af den biologiske matrix, herunder sammensætning og saltindhold5. Et stigende interesseområde i bio-nano-grænsefladen er de metabolitter, der adsorberer til NMs6. Flere undersøgelser har vist, at NM-egenskaber som med proteinerne er en nøglefaktor til bestemmelse af sammensætningen af metabolitterne i koronaen, og at de kan påvirke biologiske resultater af NM-eksponering6,7,8.
I undersøgelser af den biomolekylære korona er der fire forskellige faser til dens karakterisering, koronadannelse, isolering af biomolekylerne i koronaen, deres detektion via kvalitativ eller kvantitativ massespektrometri og identifikation9. Til dato er der vedtaget en række teknikker til at isolere proteinet korona, herunder kogning i SDS-PAGE kører buffer, opløsningsmiddel og salt ekstraktioner eller direkte fordøjelse af proteiner in situ på overfladen af NMs. Med hensyn til metabolitterne i koronaen er isolationen mere kompleks med forskellige metoder ved hjælp af opløsningsmidler eller endda opløsningen af NMs foreslået somopløsninger 8,10,11. Men i modsætning til proteinet korona en “one size fits all” tilgang er usandsynligt, at gælde for isolering af metabolitter fra NMs, på grund af det brede kemiske rum besat af metabolom og mangfoldigheden af mulige NMs. En alternativ metode er at karakterisere den biologiske matrix før og efter NM-eksponering med forskellen i metabolitkoncentrationer, der tilskrives adsorptionen af metabolitter til NMs.12
Denne alternative tilgang vil finde anvendelse på alle biofluider og NMs, og selv om den kræver dobbelt så meget analyse, giver den derfor et langt mere præcist mål for metabolit-koronaen og har ingen risiko for, at lav metabolitindvinding fra NM-overfladen forveksles med lav binding af den specifikke metabolit.
Det andet trin til den biomolekylære koronaanalyse er påvisning af biomolekylerne. Traditionelt for proteinerne i koronaen har dette været mandatet for nano-LC-MS, proteomics arbejdshest; andre tilgange såsom NMR13, 1D og 2D SDS-PAGE er også blevet anvendt. Med hensyn til metabolit corona LC-MS7, GC-MS8 og direkte infusionsmassespektrometri er blevet udnyttet14. Men en ny tilgang er for nylig begyndt at få trækkraft, nemlig kapillær elektroforese-massespektrometri (CE-MS)11,15 og har været til stede i NM labs som en standalone teknik til at karakterisere forskellige fysiske og kemiske egenskaber NMs16. CE-MS er en ortogonal separationsteknik til nanoLC-MS og GC-MS og er i stand til at gøre det muligt at detektere stærkt polære og ladede metabolitter17,18. Ce-MS er desuden velegnet til analyse af proteiner og deres efteroversættende modifikationer såsom fosforylering og glykosylering19,20,21,22. Det sidste trin, identifikation og dataanalyse kan udføres på flere måder afhængigt af, om der anvendes en kvantitativ / kvalitativ eller målrettet / ikke-målrettet tilgang, dette falder dog uden for denne protokols kompetenceområde.
CESI-MS, en kombination af CE og en nanoESI-grænseflade, er et nyligt fremskridt inden for CE-teknologi, der bruger en sheathless-grænseflade. Dette muliggør direkte tilslutning af ULTRA-low flow CE (<20 nL/min) til et massespektrometer med høj opløsning uden fortynding, hvilket resulterer i betydeligt forbedret detektionsfølsomhed23,24,25. CESI-MS gør det muligt at analysere volumenbegrænsede prøver (< 10 μL), samtidig med at der opretholdes en meget følsom analyse26. CESI-MS sammenligner også positivt med traditionelle nanoLC-MS-tilgange med lav strømningshastighed, der anvendes i proteomics og metabolomics med hensyn til reproducerbarhed27,28, gennemløb og overførsel, hvilket gør det til en spændende udsigt til den komplette biomolekylære koronakarakterisering.
For at fremhæve potentialet i CESI-MS til analyser af bio-nano-interaktioner beskriver dette arbejde det prøvepræparat, der kræves for at isolere NM biomolekylær korona fra en enkelt human plasmaprøve på en sådan måde, at data maksimeres fra både protein- og metabolitaspekterne af den komplette biomolekylære NM-korona. Mens vi rapporterer om brugen af humant plasma, vil denne protokol være lige så velegnet til andre biofluider såsom blodserum, komplet cellekultur medium, celle lysat, cerebrospinalvæske eller urin. Analyserne af disse to komponenter (proteiner og metabolitter) vil derefter blive beskrevet ved hjælp af neutrale belagte CESI kapillærer for protein korona og nøgne smeltet silica kapillærer for både kationiske og anioniske metabolitter.
Dette er den første metode, der foreslås for at karakterisere den komplette biomolekylære korona, der indeholder proteiner og metabolitter, fra samme prøve ved hjælp af CESI-MS. Evnen til at karakterisere både proteiner og metabolitter fra samme prøve vil øge mængden af data indsamlet fra en enkelt eksperimentel eksponering betydeligt, hvilket muliggør ny indsigt i koronadannelsesprocessen og dens virkninger for NMs toksicitet og effektivitet som nanomedicin. Desuden er CESI-MS en ideel platform til at karakterisere begge klasser af biomolekyler med blot en ændring af kapillær påkrævet. Fremadrettet vil nye metoder udviklet til ikke-vandig CE gøre det muligt at udføre lipidomics ved hjælp af CE-MS40, så det nu er muligt at analysere proteiner, metabolitter og lipider ved hjælp af en enkelt platform. De nuværende konventionelle tilgange ville kræve to dedikerede LC-MS-platforme, en til protein-corona og en til metabolit-koronaen. Således kan denne tilgang indsamle dobbelt så mange data ved hjælp af en enkelt analytisk platform.
Der er nogle forbehold over for denne tilgang, især med metabolit corona, da denne protokol foreslår en indirekte måling af koronaen. Som sådan kan der opstå problemer, når metabolitniveauerne er til stede ved høje koncentrationer i forhold til NMs, og det efterfølgende fald i metabolitkoncentrationen i matrixen er lille. Men i modsætning til protein corona er det usandsynligt, at en “one size fits all” tilgang til isolering af metabolit corona vil blive udviklet på grund af, at hver NM har unikke overfladekemier. Fremadrettet er det mere sandsynligt, at NM specifikke tilgange til at isolere metabolit corona vil blive udviklet og valideret dog; dette vil kun gælde for den specifikke NM. På trods af dette vil CESI-MS stadig være en yderst velegnet platform til karakterisering af de polære ladede metabolitter, uanset hvordan de isoleres. Det er også bemærkelsesværdigt, at hvis der ikke dannes en pellet under centrifugeringstrinnene, der er designet til at pellete NMs, kan der være behov for en højere centrifugalkraft; Dette vil sandsynligvis ske med mindre tætte NMs. Det er også afgørende, at alle filtreringstrin overholdes i protokollen på grund af kapillærernes smalle boring, som disse let kan blokeres, hvis partikler ikke er blevet tilstrækkeligt fjernet fra prøven.
Mens protein corona har været et intenst forskningsområde i en årrække evnen til at kombinere det med metabolit corona er et nyt interesseområde for forskere, der undersøger bio-nano interface6,14. Til dato har de fleste af disse undersøgelser fokuseret på den ikke-polære, lipidfraktion af metabolitten corona9,28. Denne nuværende metode muliggør karakterisering af de meget polære og ladede metabolitter i koronaen, som omfatter vigtige metabolitter involveret i energimetabolisme, glykolyse og DNA-syntese. Som et resultat, når det kombineres med proteomics-arbejdsgangen, er en mere holistisk karakterisering af den biomolekylære korona mulig. Dette muliggør en mere dybdegående analyse af bio-nano-interaktioner fremadrettet. Denne metode muliggør forbedret mekanistisk indsigt i receptormedieret endokytose via protein- og metabolitinteraktioner med membranreceptorer. Desuden kan interaktioner mellem proteiner og små molekyler mellem og inden for koronaer undersøges; for eksempel er det for nylig blevet vist, at proteinerne i koronaen spiller en central rolle i rekrutteringen af metabolitter15. Det er værd at bemærke, at de repræsentative resultater i figur 3 og figur 4 er absolut kvantificering af metabolitter, men en ikke-målrettet tilgang ved hjælp af multivariat dataanalyse til sammenligning af alle CE-MS-funktioner i kontroller sammenlignet med eksponeret plasma ville også belyse metabolitbinding. Der er således et betydeligt spillerum til at undersøge, hvordan og hvilke metabolitter og proteiner der påvirker deres respektive rekruttering til NM-coronas. Disse yderligere undersøgelser kan hjælpe med at designe coronas for at optimere leveringen af nanomedicin eller afdække yderligere forhindringer for deres udvikling, såsom undertrykkelse af farmaceutisk handling på grund af den biomolekylære koronablokering eller maskering af målretningsfunktioner.
CESI-MS med sine nanoskalastrømhastigheder på ca. 20 nL/min. og minimal brug af organiske opløsningsmidler giver en forbedring af de grønne og økonomiske akkreditiver i forhold til henholdsvis standard LC-MS og nanoLC-MS med hensyn til anvendelse af opløsningsmidler, de største udfordringer for metabolomics og proteomics-undersøgelser. CESI-MS tilbyder meget reproducerbare resultater for både overflytningstid og spidsbelastningsområde , som sammenligner positivt med LC-MS-baserede metoder11,15. Sammenlignet med nanoLC-MS er fremførsel desuden ikke et problem i CESI-MS. Derfor er der ikke behov for omfattende systemoprydning mellem stikprøveanalyser, hvilket i høj grad forbedrer prøvegennedringshastigheden11.
Sammenfattende er den foreslåede arbejdsgang den første til at specificere en tilgang til at karakterisere både protein- og metabolitkomponenterne i den komplette biomolekylære korona af NMs. Dette låser op for et nyt aspekt af bio-nano-interaktioner, metabolittens korona, hvilket gør det muligt at indsamle dobbelt så mange data fra den samme prøve, hvilket muliggør en mere komplet forståelse af interaktioner på bio-nano-grænsefladen.
The authors have nothing to disclose.
A.J.C, J.A.T og I.L anerkender finansiering fra Europa-Kommissionen via Horizon 2020-projektet ACEnano (Grant no. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z anerkender ph.d.-finansiering fra China Scholarship Council (CSC, No. 201507060011). R.R anerkender den finansielle støtte til Vidi-tilskudsordningen under Den Nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO Vidi 723.0160330).
1,4-Dithiothreitol | Sigma | 10197777001 | |
2,2,4,4-D4-citric | Simga | 485438-1G | Internal standard anion |
Ammonium Acetate >98% | Sigma | A1542 | |
Ammonium Bicarbonate >99.5% | Sigma | 09830 | |
Capillary cartridge coolant | Sciex | 359976 | |
CESI 8000 instrument | Sciex | A98089 | |
CESI Cap | Sciex | B24699 | |
CESI Vials | Sciex | B11648 | |
Chloroform | Sigma | 650498 | Toxic, use in a fume hood |
Glacial Acetic acid | Sigma | A6283 | |
Hydrochloric acid 1mol/L | Sigma | 43617 | |
Iosoacetamide | Sigma | I1149 | |
L-methionine sulfone | Sigma | M0876-1G | Internal standard cation |
Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve) | Sigma | 14262 | Use in a fume hood |
Microvials | Sciex | 144709 | |
nanoVials | Sciex | 5043467 | |
Neutral Surface Cartridge 30 µM ID x 90 cm total length | Sciex | B07368 | |
OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source | Sciex | B07363 | B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers |
OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 µm ID x 90 cm total length | Sciex | B07367 | |
Phospahte buffered saline 10x | Sigma | P7059 | |
Pierce C18 Tips, 100 µL bed | Thermo Fisher Scientific | 87784 | |
Polystyrene 100 nm | Polysciences Inc | 876 | |
Polystyrene carboxylated 100 nm | Polysciences Inc | 16688 | |
Polystyrene carboxylated 1000 nm | Polysciences Inc | 08226 | |
Rapigest SF (surfactant) | Waters | 186001860 | |
Sequencing Grade modified Trypsin | Promega | V5111 | |
SiO2 Ludox TM-40 | Sigma | 420786 | |
Sodium Hydroxide solution | Simga | 72079 | |
TiO2 Dispex coated | Promethion particles | Bespoke particles | |
TiO2 PVP coated | Promethion particles | Bespoke particles | |
TiO2 uncoated | Promethion particles | Bespoke particles |