Высокоразмерная проточная цитометрия для анализа иммунной функции рассеченных тканей имплантата
Summary
Выделение клеток из рассеченных имплантатов и их характеристика с помощью проточной цитометрии может внести существенный вклад в понимание паттерна иммунного ответа против имплантатов. В данной работе описан точный метод выделения клеток из рассеченных имплантатов и их окрашивания для проточного цитометрического анализа.
Abstract
Успех имплантации выращенной в лаборатории ткани или медицинского изделия человеку зависит от иммунного ответа хозяина-реципиента. Рассматривая имплантат как инородное тело, враждебный и нерегулируемый иммунный ответ может привести к отторжению имплантата, в то время как регулируемый ответ и восстановление гомеостаза могут привести к его принятию. Анализ микроокружения имплантатов, препарированных в условиях in vivo или ex vivo , может помочь в понимании паттерна иммунного ответа, что в конечном итоге может помочь в разработке новых поколений биоматериалов. Проточная цитометрия является хорошо известным методом характеристики иммунных клеток и их субпопуляций на основе маркеров их клеточной поверхности. В этом обзоре описывается протокол, основанный на ручном нарезе кубиками, ферментативном расщеплении и фильтрации через клеточный фильтр для выделения однородных клеточных суспензий из рассеченной ткани имплантата. Кроме того, был разъяснен протокол многоцветного окрашивания методом проточной цитометрии, а также этапы первоначальной настройки цитометра для определения характеристик и количественного определения этих изолированных клеток с помощью проточной цитометрии.
Introduction
Достижения в области медицины привели к частому использованию имплантируемых материалов для поддержки функции или повторного роста поврежденных тканей 1,2. К ним относятся такие устройства, как кардиостимуляторы, реконструктивные косметические имплантаты и ортопедические пластины, используемые для фиксации переломов костей 3,4. Тем не менее, материалы, используемые для изготовления этих имплантатов, и места, в которые они имплантированы, играют важную роль в определении успеха этих имплантатов 5,6,7. Будучи инородными телами, эти имплантаты могут вызывать иммунный ответ со стороны хозяина, который может привести либо к отторжению, либо к толерантности8. Этот фактор подтолкнул исследования биоматериалов к созданию материалов, которые могут вызвать желаемый иммунный ответ после имплантации 9,10,11,12.
Иммунный ответ является важным требованием в области регенеративной медицины, когда ткань или орган выращиваются вокруг каркаса биоматериала (скаффолда) в лаборатории для замены поврежденной ткани или органа13,14,15,16. В регенеративной медицине цель состоит в том, чтобы заменить отсутствующие или поврежденные ткани с помощью клеток, сигналов и каркасов, каждый из которых может быть в значительной степени модулирован иммуннымиреакциями. Более того, даже в тех случаях, когда иммунный ответ желателен, оченьредко желательным является отсутствие иммунной активности, а не наличие регуляторного профиля. Такие методы, как проточная цитометрия, могут играть значительную роль в характеристике характера иммунного ответа на различные биоматериалы, используемые для покрытия имплантатов или для разработки каркасов для тканевой инженерии19.
Эта информация, в свою очередь, в конечном итоге поможет в разработке биоматериалов для имплантатов, которые могут хорошо переноситься иммунной системой, или в разработке каркасов, которые могут играть конструктивную роль в тканевой инженерии. Надлежащая подготовка образцов для анализа методом проточной цитометрии является важным шагом для предотвращения неточных результатов при иммунохарактеристике с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток20,21. Поэтому в данном обзоре представлена подробная методология, которая может быть использована для выделения клеток из ткани каркаса, окрашивания клеточной суспензии и анализа методом проточной цитометрии.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данном обзоре описана подробная методика выделения клеток из имплантатов биоматериала для получения однородной клеточной суспензии. Кроме того, был предоставлен подробный протокол окрашивания клеточной суспензии для многоцветной проточной цитометрии, а также шаги по настройке пр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было частично поддержано Программой внутренних исследований NIH, включая Национальный институт биомедицинской визуализации и биоинженерии. Отказ от ответственности: NIH, его должностные лица и сотрудники не рекомендуют и не одобряют какие-либо компании, продукты или услуги.
Materials
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
References
- Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
- Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).
- Rolfe, B., et al., Eberli, D., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. , (2011).
- Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions. Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).
- Kang, C. -. W., Fang, F. -. Z. State of the art of bioimplants manufacturing: part I. Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).
- Sadtler, K., et al. Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds. Biomaterials. 192, 405-415 (2019).
- Sadtler, K., et al. Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).
- Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. Materials engineering for immunomodulation. Nature. 462 (7272), 449-460 (2009).
- Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling. Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Zhang, L., et al. Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction. Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).
- Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction. Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).
- Tan, H., Marra, K. G. Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications. Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).
- Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials. Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).
- Sadtler, K., et al. Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells. Science. 352 (6283), 366-370 (2016).
- Gower, R. M., et al. Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression. Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).
- Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).
- Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A. Engineering antigen-specific immunological tolerance. Current Opinion Immunology. 35, 80-88 (2015).
- Sadtler, K., Elisseeff, J. H. Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials. Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Shapiro, H. M. . Practical Flow Cytometry. , (2003).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2013).
- Wolf, M. T., et al. A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy. Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).
- Kahng, J., et al. Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts. Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).
- Sionov, R. V., et al. Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties. Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).
