Højdimensionalitetsflowcytometri til immunfunktionsanalyse af dissekeret implantatvæv
Summary
Isolering af celler fra dissekerede implantater og deres karakterisering ved flowcytometri kan bidrage væsentligt til at forstå mønsteret af immunrespons mod implantater. Dette papir beskriver en præcis metode til isolering af celler fra dissekerede implantater og deres farvning til flowcytometrisk analyse.
Abstract
Succesen med at implantere laboratoriedyrket væv eller medicinsk udstyr hos et individ er underlagt modtagerværtens immunrespons. I betragtning af et implantat som fremmedlegeme kan et fjendtligt og dysreguleret immunrespons resultere i afvisning af implantatet, mens et reguleret respons og genvinding af homeostase kan føre til dets accept. Analyse af mikromiljøerne af implantater dissekeret under in vivo eller ex vivo indstillinger kan hjælpe med at forstå mønsteret af immunrespons, som i sidste ende kan hjælpe med at udvikle nye generationer af biomaterialer. Flowcytometri er en velkendt teknik til karakterisering af immunceller og deres undergrupper baseret på deres celleoverflademarkører. Denne gennemgang beskriver en protokol baseret på manuel terning, enzymatisk fordøjelse og filtrering gennem en cellesi til isolering af ensartede cellesuspensioner fra dissekeret implantatvæv. Yderligere er en flerfarvet flowcytometrifarvningsprotokol blevet forklaret sammen med trin til indledende cytometerindstillinger for at karakterisere og kvantificere disse isolerede celler ved flowcytometri.
Introduction
Fremskridt inden for medicin har ført til hyppig brug af implanterede materialer til støtte for funktionen eller genvæksten af beskadiget væv 1,2. Disse omfatter enheder såsom pacemakere, rekonstruktive kosmetiske implantater og ortopædiske plader, der anvendes til knoglefrakturfiksering 3,4. Imidlertid spiller de materialer, der bruges til at fremstille disse implantater, og de steder, hvor de implanteres, vigtige roller i bestemmelsen af succesen med disse implantater 5,6,7. Som fremmedlegemer kan disse implantater generere et immunrespons fra værten, der enten kan føre til afvisning eller tolerance8. Denne faktor har drevet biomaterialeforskning til at generere materialer, der kan tiltrække det ønskede immunrespons efter implantation 9,10,11,12.
Immunresponset er et væsentligt krav inden for regenerativ medicin, hvor et væv eller et organ dyrkes omkring et biomaterialeskelet (stillads) i et laboratorium til udskiftning af et beskadiget væv eller organ13,14,15,16. I regenerativ medicin er målet at erstatte manglende eller beskadiget væv ved brug af celler, signaler og stilladser, som hver især kan moduleres kraftigt af immunresponser17. Selv når der ønskes manglende immunrespons, er det desuden meget sjældent et fravær af immunaktivitet snarere end tilstedeværelsen af en regulatorisk profil, der ønskes18. Teknikker som flowcytometri kan spille en væsentlig rolle i karakteriseringen af mønsteret af immunrespons på forskellige biomaterialer, der anvendes til belægning af implantatanordninger eller til udvikling af stilladser til vævsteknik19.
Disse oplysninger vil igen i sidste ende hjælpe med at udvikle biomaterialer til implantater, der kan tolereres godt af immunsystemet eller udvikle stilladser, der kan spille en konstruktiv rolle i vævsteknik. Korrekt forberedelse af prøver til analyse ved flowcytometri er et vigtigt skridt for at undgå unøjagtige resultater i immunkarakterisering via fluorescensaktiveret cellesortering20,21. Derfor præsenterer denne gennemgang en detaljeret metode, der kan bruges til isolering af celler fra stilladsvæv, farvning af cellesuspensionen og analyse ved flowcytometri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne gennemgang beskriver en detaljeret metode til isolering af celler fra biomaterialeimplantater for at opnå en ensartet cellesuspension. Derudover er der tilvejebragt en detaljeret protokol til farvning af cellesuspensionen til flerfarvet flowcytometri sammen med trinene til konfiguration af et flowcytometer for optimale resultater. Celleisoleringsmetoder kan involvere flere trin, ofte ved hjælp af manuel vævsdissektion efterfulgt af enzymatisk fordøjelse med proteolytiske enzymer for at dissociere den ekstracell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev delvist støttet af NIH’s intramurale forskningsprogram, herunder National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering. Ansvarsfraskrivelse: NIH, dets officerer og medarbejdere anbefaler eller godkender ikke noget firma, produkt eller service.
Materials
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 6 Well Plate | Fisher Scientific | 07-000-646 | |
| BD Brilliant Stain Buffer Plus | BD Biosciences | 566385 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | For only fixing cells |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A7906 | For preparing FACS staining buffer |
| CD11b AF700 | Biolegend | 101222 | Clone: M1/70 |
| CD11c PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 117325 | Clone: N418 |
| CD197 PE/Dazzle594 | Biolegend | 120121 | Clone: 4B12 |
| CD200R3 APC | Biolegend | 142207 | Clone: Ba13 |
| CD206 PE | Biolegend | 141705 | Clone: C068C2 |
| CD45 BUV737 | BD Biosciences | 612778 | Clone: 104/A20 |
| CD86 BUV395 | BD Biosciences | 564199 | Clone: GL1 |
| CD8a BV421 | Biolegend | 100737 | Clone: 53-6.7 |
| Comp Bead anti-mouse | BD Biosciences | 552843 | For compensation control |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I) |
| F4/80 PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone: BM8 |
| Fc Block | Biolegend | 101301 | Clone: 93 |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | For fixing and permeabilization of cells. |
| HEPES buffer | Thermo Fisher | 15630080 | Buffer to supplement cell media |
| Liberase | Millipore Sigma | 5401127001 | Blend of purified Collagenase I and Collagenase II |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher | L23105 | Viability dye |
| Ly6c AF488 | Biolegend | 128015 | Clone: HK1.4 |
| Ly6g BV510 | Biolegend | 127633 | Clone: 1A8 |
| MHCII BV786 | BD Biosciences | 742894 | Clone: M5/114.15.2 |
| Phosphate buffer saline | Thermo Fisher | D8537 | |
| RPMI | Thermo Fisher | 11875176 | Cell culture media |
| Siglec F BV605 | BD Biosciences | 740388 | Clone: E50-2440 |
| V-bottom 96-well plate |
References
- Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
- Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).
- Rolfe, B., et al., Eberli, D., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. , (2011).
- Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions. Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).
- Kang, C. -. W., Fang, F. -. Z. State of the art of bioimplants manufacturing: part I. Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).
- Sadtler, K., et al. Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds. Biomaterials. 192, 405-415 (2019).
- Sadtler, K., et al. Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040 (2016).
- Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. Materials engineering for immunomodulation. Nature. 462 (7272), 449-460 (2009).
- Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling. Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).
- Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
- Zhang, L., et al. Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction. Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).
- Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction. Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).
- Tan, H., Marra, K. G. Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications. Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).
- Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials. Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861 (2019).
- Sadtler, K., et al. Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells. Science. 352 (6283), 366-370 (2016).
- Gower, R. M., et al. Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression. Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).
- Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).
- Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A. Engineering antigen-specific immunological tolerance. Current Opinion Immunology. 35, 80-88 (2015).
- Sadtler, K., Elisseeff, J. H. Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials. Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Shapiro, H. M. . Practical Flow Cytometry. , (2003).
- Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2013).
- Wolf, M. T., et al. A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy. Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).
- Kahng, J., et al. Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts. Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).
- Sionov, R. V., et al. Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties. Journal of Visualized Experiments. (100), e52933 (2015).
- Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
- Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).
