여기에서, 우리는 초파리 배아 단백질 및 RNA의 검출 및 국소화를 위한 프로토콜을 기술한다 수집에서 사전-포베딩 및 포매, 면역염색, 및 mRNA 를 계내 혼성화에 이르게 한다.
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방법 논문
초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 RNA 계내 분포를 위한 프로토콜
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
칼슘 유도 칼슘 방출 신호 (CICR)는 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을합니다. 세포 증식 및 아폽토시스, 발달 및 노화, 뉴런 시냅스 가소성 및 재생에 이르기까지 모든 세포 활성은 Ryanodine 수용체 (RyRs)와 관련이 있습니다. 칼슘 신호 전달의 중요성에도 불구하고, 초기 개발에서 그 기능의 정확한 메커니즘은 불분명하다. 임신 기간이 짧은 유기체로서, 초파리 멜라노가스터의 배아는 발달 중에 CICR 관련 단백질 및 그들의 조절자의 분포 및 국소화를 조사하기위한 주요 연구 대상입니다. 그러나 지질이 풍부한 배아와 키틴이 풍부한 쵸리온으로 인해 유리 표면에 배아를 장착하기가 어려워 유용성이 제한됩니다. 이 연구에서는 초파리 배아를 슬라이드에 부착하는 것을 크게 향상시키는 실용적인 프로토콜과 성공적인 조직 화학, 면역 조직 화학 및 현장 혼성화를위한 세부 방법을 소개합니다. 크롬 명반 젤라틴 슬라이드 코팅 방법 및 배아 사전 임베딩 방법은 초파리 배아 단백질 및 RNA 발현을 연구하는 데 수율을 극적으로 증가시킵니다. 이 접근법을 입증하기 위해, 우리는 초파리 멜라노가스터의 초기 배아 발달 동안 RyR의 잘 알려진 조절자 인 DmFKBP12 / Calstabin을 연구했습니다. 우리는 싱크로나이셜 배반배엽 단계에서 DmFKBP12를 확인하고 개발 중에 DmFKBP12의 동적 발현 패턴을 보고 하였다: 초기에는 세포융합 배반엽에서 고르게 분포된 단백질로서, 그 후 세포 배반배엽 동안 피질의 기저층으로 미리 국소화하고, 초기 위축에서 삼겜층 단계 동안 원시적 뉴런 및 소화 구조에 분배하기 전에. 이 분포는 RyR이 이러한 층에서 유래 한 중요한 장기 시스템에서 중요한 역할을 설명 할 수 있습니다 : 식도 하 및 식도 신경절, 복부 신경계 및 근골격계.
서론
칼슘 유도 칼슘 방출 신호전달(CICR)은 골격/평활근 및 심장 혈관 기능, 세포 증식 및 아폽토시스, 발달, 노화, 신경 시냅스 가소성 및 재생과 같은 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다1,2,3,4,5,6 . 리아노딘 수용체 (RyRs) 및 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트 수용체 (IP3Rs)는 그들의 조절인자인 단백질 키나아제 A (PKA), Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나아제 II (CaMKII), FK506 결합 단백질 (FKBPs), 칼세퀘스트린 (CSQ), 트리아딘 및 junctin1,2,3,4,5,6에 의해 조절되는 칼슘
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프로토콜
1. 포도즙 한천 플레이트의 제조
- 한천 5g과 자당 5g을 증류수 150mL에 첨가한다. 한천과 자당이 완전히 용해 될 때까지 전자 레인지를 사용하여 삶으십시오. 100 % 포도 주스 50 mL와 용액을 함께 섞는다.
- 100% 프로피온산 1 mL를 첨가하여 최종 농도를 0.5% 프로피온산으로 만든다. 준비된 용액 25 mL를 각 플레이트에 붓는다. 한천이 응고된 후, 배지를 4°C에 보관한다.
2. 코팅 슬라이드
- 슬라이드를 세제로 전처리하십시오. 슬라이드를 수돗물로 3 번, 증류수로 한 번 씻으십시오. 이어서, 슬라이드를 45°C 오븐에서 2시간 동안 건조시켰다.
- 슬라이드를 약 450 mL의 이크로메이트 칼륨 황산 용액 (20 g의 디크로메이트 칼륨, 40 mL의 증류수 및 400 mL의 진한 황산)에 24 시간 동안 담그십시오. 슬라이드를 수돗물로 3 번, 증류수로 한 번 씻으십시오.
- 슬라이드를 45°C 오븐에서 두 시간 동안 건조시킨다. 95% 에탄올에 2시간 이상 담그십시오.
- 황산크롬칼륨 0.5g과 젤라틴 5g을 증류수 1L에 첨가한다. 사용....
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결과
도면은 시험 및 실험을 위해 높은 지질 및 키틴 함유 초파리 배아 (표 1)를 유리 슬라이드 표면에 부착시키는 문제를 극복하기 위해 사용되는 프로토콜을 설명합니다. 그림 1에 표시된 크롬 명반 젤라틴 슬라이드 코팅 방법을 활용하여 슬라이드 표면에 초파리 배아의 부착을 강화했으며, 그림 2에 표시된 배아 사전 임베딩 방법을 사용하면 네 가지 초기 개발 단계 (즉, 세포 배반배엽, 세포 배반엽, 초파리 배아의 초기 및 후기 gastrula). 도 3은 세포융합 및 세포성 배반배엽 단계에서 검출된 FKBP12/Calstabin 항체의 단백질 분포를 보여준다. 이러한 조직화학적 결과로부터, FKBP12 발현은 동시성 배반배엽(패널 A 내지 H)에서 덜 편광되고, 이어서 트로피토배엽 .......
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토론
RyRs 및 IP3Rs 매개 칼슘 신호 전달은 척추 동물 및 무척추 동물 모두의 많은 생리 학적 및 병리학 적 과정에서 근본적인 경로입니다1,2,3,4. 인간에서, RyR2 유전자에서 CPVT 관련 R4496C 돌연변이와 같은 점 돌연변이는 심근세포의 사르코플라스마 망상으로부터 칼슘 누출을 유발하여, 심장 기능 장애를 초래한다. 이러한 돌연변이는 신체 활동 중 갑작스런 심장 사망의 위험이 높은 부정맥으로 존재하며,이 돌연변이를 운반하도록 설계된 마우스 모델에서 재현 가능합니다. 운동 조건 하에서,이 칼슘 누출 돌연변이를 가진 마우스는 야생형 카운터 파트에 의해 입증되지 않은 심장 갑작스런 사망을 경험했습니다.18,20,21,22.
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (#31771377 / 31571273 / 31371256), 국립 교육부 (#MS2014SXSF038)의 외국 저명한 과학자 프로그램 (National Department of Education Central Universities Research Fund) (#GK201301001 / 201701005 / GERP-17-45)의 지원을 받았으며 XZ는 우수 박사 학위 논문 기금 (#2019TS082 / 2019TS079), 산시 성 교육부의 핵심 프로그램 (#20JS138), 산시 성 과학 기술부의 자연 과학 기초 연구 프로그램 청소년 프로젝트 (#2020JQ-885).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| -20° C 냉장고 | Meiling 생물학 & 의료용 | DW-YL270 | 리젠트 보관에 사용 |
| -80° C 초저온 냉장고 | Thermo | Forma 90 시리즈 | 리젠트 저장에 사용 |
| 한천 | : Sigma-Aldrich | WXBB6360V | 포도 주스 한천 플레이트 |
| 준비 Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | digoxigenin 표지 화합물 |
| 검출 : 생화학 인큐베이터 | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | 현장 Hybridization |
| Bouin의 솔루션 | Sinopharm 화학 시약 베이징 | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm 화학 시약 베이징 | 10001018 | 코팅 슬라이드 |
| 항온 수조 | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin 염색, 면역 조직 화학, 현장 혼성화 및주기적 산 -은 메테 나민 염색 |
| Dako REAL EnVision 감지 시스템 | Dako | K5007 | 면역조직화학반응 또는 제자리 혼성화 반응에서 1차 항원 항체에 결합하고 표적은 염색으로 표지됩니다. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | 현장 교잡 |
| DIG RNA 라벨링 키트 | Roche | 11093274910 | SP6 및 T7 RNA 중합효소를 사용한 체외 전사를 통한 diagoxigenin-UTP로 RNA 라벨링 |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 < | em>Drosophila melanogaster mutant |
| 의 재고전기 돌풍 건조 오븐 | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | 코팅 슬라이드 및 파라핀 임베딩용 |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin 염색 |
| 에탄올 | Sinopharm 베이징에서 화학 시약 | 100092680파라 | 핀 임베딩, Hematoxylin-Eosin 염색, 면역조직화학, 현장 혼성화 및 주기적인 산-은 Methenamine 염색 |
| 베이징의 젤라틴 | 시노팜 화학 시약 | 10010328 | 코팅 슬라이드 |
| 금 염화물 | 시그마 - 알드리치 | 379948 | 주기적 산 -은 메테 나민 염색 |
| 헤마 톡실린 | 시그마 - 알드리치 | H3136 | 헤마 톡실린 -에오신 염색 |
| 고순도 PCR 제품 정제 키트 | Roche | 11732668001 | PCR 제품 |
| 정제 용지능형 항온 및 습도 상자 | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | 플라이 유지 보수 |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | |
| 10014108 | 초파리 배아 수집 | ||
| Hematoxylin-Eosin 염색, 면역조직화학, 현장 혼성화 및 주기적 산-은 메테나민 염색 | |||
| 현미경 슬라이드 | MeVid Labware 제조 | P105-2001 | 코팅 슬라이드 |
| 베이징의 중성 검 | Sinopharm 화학 시약 | 10004160 | Hematoxylin-Eosin 염색 |
| N-헵탄 | Sinopharm 베이징의 화학 시약 | 40026768 | Drosophila Embryo 수집 |
| 파라핀 저미는 | 기계 Huahai 과학 기구 | HH-2508III | 현장 교잡 |
| 파라핀 | Sinopharm 베이징에 화학 시약 | 69019461 | 파라핀 끼워넣 |
| pH/mV 미터 | Sartorius | PB-10 | 해결책의 PH 값 결정을 위해 |
| 질산은 | Sinopharm 베이징 10018461에서 화학 시약 | 주기적인 산-은 메테나민 염색 | |
| 초순수 미터 | Thermo | AFXI-0501-P | 현장 하이브리드화 |
| Xylene | Sinopharm 화학 시약 베이징 | 10023418 | 파라핀 임베딩 |
참고문헌
- Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
- Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
- Fan, J., et al.
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재인쇄 및 허가
