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생화학

Eliminación Y Reemplazo De Ligandos Endógenos De Proteínas Ligadas A Lípidos Y Alérgenos

Published: February 24, 2021
doi:
10.3791/61780
, ,
1Nuclear Magnetic Resonance Group,National Institute of Environmental Health Sciences

Summary

Este protocolo describe el retiro de lípidos endógenos de alergénicos, y su reemplazo con ligands usuario-especificados con la CLAR de la invertir-fase juntada con el recocido termal. 31 El P-RMN y el dicroísmo circular permiten la confirmación rápida del retiro/del cargamento del ligand, y la recuperación de la estructura alergénica nativa.

Abstract

Muchos alérgenos importantes se unen a moléculas hidrofóbicas similares a lípidos, incluyendo Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 y Fel d 1. Estos ligandos se retienen fuertemente y tienen el potencial de influir en el proceso de sensibilización, ya sea a través de la estimulación directa del sistema inmunológico o la alteración de las propiedades biofísicas de la proteína alergénica. Para controlar estas variables, se requieren técnicas para la eliminación de ligandos endógenos unidos y, si es necesario, la sustitución por lípidos de composición conocida. El alérgeno de cucaracha Bla g 1 encierra una gran cavidad hidrofóbica que se une a una mezcla heterogénea de lípidos endógenos cuando se purifica utilizando técnicas tradicionales. Aquí, describimos un método a través del cual estos lípidos se eliminan utilizando HPLC de fase inversa seguido de recocido térmico para producir Bla g 1 en su forma apo o recargado con una mezcla definida por el usuario de cargas de ácidos grasos o fosfolípidos. El acoplamiento de este protocolo con ensayos bioquímicos revela que las cargas de ácidos grasos alteran significativamente la termoestabilidad y la resistencia proteolítica de Bla g 1, con implicaciones aguas abajo para la tasa de generación de epítopos de células T y alergenicidad. Estos resultados destacan la importancia de los protocolos del retiro/de la recarga del lípido tales como el descrito adjunto al estudiar alergénicos de fuentes recombinantes y naturales. El protocolo es generalizable a otras familias de alérgenos incluyendo lipocalins (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) y Uteroglobin (Fel d 1), proporcionando una valiosa herramienta para estudiar el papel de los lípidos en la respuesta alérgica.

Introduction

Un estudio de la base de datos de alérgenos revela que los alérgenos se encuentran en sólo el 2% de todas las familias de proteínas conocidas, lo que sugiere que las propiedades funcionales y biofísicas comunes contribuyen a la alergenicidad1. De estas propiedades, la capacidad de unir cargas lipídicas parece estar fuertemente sobrerrepresentada entre los alérgenos, lo que sugiere que estas cargas pueden influir en el proceso de sensibilización1. De hecho, se ha demostrado que el alérgeno de la nuez de Brasil Ber e 1 requiere co-administración con su lípido endógeno para realizar todo su potencial sensibilizante2. Estos lípidos podrían potencialmente estimular el sistema inmune directamente como lo ilustran los alérgenos ácaros Der p 2 y Der p 7, los cuales comparten una fuerte homología estructural con las proteínas de unión a LPS3,4,5. Sobre la base de esta observación se propuso que Derp 2 y Der p 7 podrían unirse a los lípidos bacterianos y estimular directamente el sistema inmune del huésped a través de la señalización mediada por TLR4, facilitando el proceso de sensibilización5,6. También es posible que los lípidos endógenos unidos podrían alterar las propiedades biofísicas de las propias proteínas alergénicas. Por ejemplo, la capacidad de Sin a 2 (mostaza) y Ara h 1 (cacahuetes) para interactuar con vesículas fosfolípidas mejoró significativamente su resistencia a la degradación gástrica y endosomal7,mientras que el ligando que se une al alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1 alteró tanto la tasa de procesamiento endosomal como la diversidad de los péptidos resultantes8. Esto es particularmente relevante para la alergenicidad dada la correlación que se ha observado entre la estabilidad, la generación de epítopos de células T y la alergenicidad para proteínas como Bet v 1 y Bla g 1; este último de los cuales será objeto de este trabajo9,10.

Bla g 1 representa el miembro prototípico de la familia de proteínas de insectos alérgenos mayores (MA), y posee una estructura única compuesta por 12 hélices alfa anfipáticas que encierran una cavidad hidrofóbica anormalmente grande9,11. La estructura cristalina de rayos X disponible de Bla g 1 muestra densidad de electrones dentro de esta cavidad consistente con ligandos de fosfolípidos o ácidos grasos unidos; una conjetura confirmada por 31P-RMN y espectrometría de masas. Estas cargas eran de naturaleza heterogénea y su composición dependía en gran medida de la fuente alergénica, observó diferentes perfiles lipídicos para bla g 1 recombinante expresado en E. coli y P. pastoris. Curiosamente, Bla g 1 purificado de su fuente natural de alérgenos (frass cucaracha) contenía predominantemente ácidos grasos dentro de su sitio de unión, con una mezcla de palmitato, oleato y estearato que se identifica como sus ligandos “naturales”9,11. La capacidad de Bla g 1 para retener lípidos y ácidos grasos después de múltiples pasos de purificación dificulta los esfuerzos para estudiar la proteína de forma aislada. Por el contrario, se ha sugerido que los ligandos naturales palmitato, estearato y oleato de Bla g 1 (en adelante, nMix) juegan un papel clave tanto en su alergenicidad como en su función biológica nativa9. Sin embargo, estos ligandos no están presentes en Bla g 1 obtenidos de fuentes recombinantes, por lo que es difícil evaluar esta hipótesis. Se han observado problemas similares para otros alérgenos de unión a lípidos como Bet v1 12,13. Para facilitar el estudio sistemático de las interacciones lípido-alergénico hemos desarrollado un protocolo a través del cual los alérgenos pueden ser cuantitativamente despojados de sus lípidos endógeno unidos y reconstituidos en forma de Apo o cargados con ligandos específicos.

Los alérgenos se purifican más comúnmente de sus fuentes naturales o recombinantes mediante cromatografía de afinidad y/o cromatografía de exclusión de tamaño. Aquí, introducimos un paso de purificación adicional en forma de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) empleando una columna C18 de fase inversa a partir de la cual el alérgeno se ela en un disolvente orgánico similar a los protocolos desarrollados para proteínas de unión a ácidos grasos14. La proteína resultante se somete entonces a un paso de recocido térmico en ausencia o presencia de ácidos grasos y/o fosfolípidos. Además de recuperar el pliegue nativo de Bla g 1, las temperaturas elevadas aumentan la solubilidad y accesibilidad de las cargas lipídicas, produciendo Bla g 1 en forma apo o uniformemente cargada con el ligando hidrofóbico deseado. 31 Los espectros de P-RMN de Bla g 1 purificados de esta manera confirmaron el retiro completo de ligands endógeno ligados y el reemplazo uniforme con los compuestos deseados, mientras que el dicroísmo circular confirmó la recuperación acertada del doblez de Bla g 1. La utilidad de este método se destaca en un trabajo reciente en el que se encontró que la unión a la carga mejora la termoestabilidad Bla g 1 y la resistencia proteolítica, alterando la cinética de la generación de epítopos de células T con posibles implicaciones para la sensibilización y la alergenicidad9.

Protocol

1. Bla g 1 clonación Obtener el gen para el alérgeno de cucaracha Bla g 1.0101 (residuos 34-216), que representa una sola repetición del dominio MA. En aras de la simplicidad, Bla g 1 se utilizará a lo largo de la obra para representar esta sola repetición, en lugar de toda la transcripción de Bla g 1.0101. Subclone el gene de Bla g 1 en el vector deseado. En este estudio, el gen que contiene una etiqueta de la S-transferasa del glutatión N-terminal (GST) acoplada a un sitio de…

Representative Results

Mediante cromatografía de afinidad, el GST-Bla g 1 recombinante se aisló fácilmente a un alto nivel de pureza(Figura 1A),produciendo un rendimiento de ~2-4 mg/L de cultivo celular. La incubación durante la noche con proteasa tev a 4 °C es suficiente para eliminar la etiqueta GST, produciendo el producto final a ~ 24 kDa. Tenga en cuenta que en este caso hay una cantidad significativa de GST-Bla g 1 en las fracciones de flujo y lavado, lo que sugiere que se superó la capacidad de unión de la resina…

Discussion

El protocolo descrito en este trabajo se ha aplicado con éxito para estudiar sistemáticamente las propiedades de unión lipídicas de Bla g 1. Esto reveló una correlación entre la unión a la carga, la termoestabilidad y el procesamiento endosomal, el último de los cuales se correlacionó con la disminución en la generación de un epítopo de células T conocido con posibles implicaciones para la inmunogenicidad9,18. Además de Bla g 1, se ha demostrado que…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer al Dr. Tom Kirby, Scott Gabel y al Dr. Robert London por su ayuda y asistencia a lo largo de este trabajo, junto con el Dr. Bob Petrovich y Lori Edwards por el uso de su instrumentación y su asistencia en la generación de las construcciones Bla g 1 empleadas en este estudio. Agradecemos a Andrea Adams por su ayuda con la espectrometría de masas, y al Dr. Eugene DeRose por su ayuda con la instrumentación de RMN. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros de los NIH, Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental, Z01-ES102906 (GAM). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental.

Materials

Bla g 1 Gene  Genescript N/a Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216
Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) Indoor biotechnologies N/a Custom order
Agilent 1100 Series HPLC System Agilent G1315B, G1311A, G1322A UV Detector, Pump, and Degasser
Agilent DD2 600 MHz spectrometer Agilent N/a
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Amicon UFC-1008
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
Benzonase Sigma-Aldrich E1014-5KU
Broad- band 5 mm Z-gradient probe Varian N/a
ChemStation for LC (Software) Agilent N/a
cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) Avanti Polar Lipids 850365C
E. Coli BL21 DE3 Cells New England Biolabs C2530H
Freezone 4.5 Freeze Dry System Labconco 7750000
Glutathione Resin Genescript L00206
Glutathione, Reduced Fisher Scientific BP25211
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher Scientific 34060
Jasco  CD spectropolarimeter Jasco J-815
Millex Syringe Filter Unit EMD Millipore SLGS033SS
NMRPipe (Software) Delaglio et al.  N/a Delaglio, F. et al. Nmrpipe – a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995).
NMRViewJ (Software) Johnson et al.  N/a Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994).
Oleic acid Sigma-Aldrich O1008
Pierce BCA Protein Assay Sigma-Aldrich BCA1-1KT
Polaris 5 C18-A 250×10.0 mm HPLC Column Agilent SKU: A2000250X100
SD-200 Vacuum Pump Varian VP-195
Sodium Cholate Hydrate Sigma-Aldrich C6445
Sodium Palmitate Sigma-Aldrich P9767
Sodium Stearate Sigma-Aldrich S3381
VnmrJ (Software) Varian N/a
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References

  1. Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
  2. Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
  3. Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
  4. Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
  5. Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
  6. Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
  7. Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
  8. Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
  9. Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
  10. Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
  11. Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
  12. Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
  13. Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
  14. Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
  15. Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. 생화학. 24 (15), 3821-3826 (1985).
  16. Delaglio, F., et al. Nmrpipe – a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  17. Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
  18. Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
  19. Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
  20. Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
  21. Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
  22. Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
  23. Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
  24. Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
  25. Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
  26. Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
  27. Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
  28. Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
  29. Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
  30. Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
  31. Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
  32. Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
  33. de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
  34. Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
  35. Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
  36. Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).

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Keywords: Endogenous LigandsLipid-bound ProteinsAllergensReverse-phase HPLCThermal AnnealingSolubilizationBla G 1De-lipidationLyophilizationProtein Yield
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Foo, A. C. Y., Thompson, P. M., Mueller, G. A. Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens. J. Vis. Exp. (168), e61780, doi:10.3791/61780 (2021).
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