إزالة واستبدال الليغندات الذاتية من البروتينات والمواد المسببة للحساسية المرتبطة بالدهون
Summary
يصف هذا البروتوكول إزالة الدهون الذاتية من مسببات الحساسية ، واستبدالها بالليجاندات المحددة من قبل المستخدم من خلال HPLC في المرحلة العكسية إلى جانب التلين الحراري. 31 P-NMR و dichroism دائرية تسمح لتأكيد سريع لإزالة ليجند / التحميل، واستعادة بنية مسببات الحساسية الأصلية.
Abstract
ترتبط العديد من المواد المسببة للحساسية الرئيسية بالجزيئات الشبيهة بالدهون الكارهة للماء ، بما في ذلك Mus m 1 و Bet v 1 و Der p 2 و Fel d 1. يتم الاحتفاظ بهذه الليجاندات بقوة ولها القدرة على التأثير على عملية التوعية إما من خلال تحفيز الجهاز المناعي مباشرة أو تغيير الخصائص الفيزيائية الحيوية للبروتين المسبب للحساسية. من أجل السيطرة على هذه المتغيرات، وهناك حاجة إلى تقنيات لإزالة الليجانات ملزمة داخليا، وإذا لزم الأمر، واستبدال مع الدهون من تكوين معروف. يرفق مسبب الحساسية في الصرصور Bla g 1 تجويفا مائيا كبيرا يربط خليطا غير متجانس من الدهون الذاتية عند تنقيته باستخدام التقنيات التقليدية. هنا، ونحن نصف طريقة من خلالها تتم إزالة هذه الدهون باستخدام HPLC عكس المرحلة تليها التلأليد الحراري لتسفر Bla g 1 في شكلها أبو أو إعادة تحميلها مع خليط من الأحماض الدهنية أو الشحنات فوسفوليبيد المعرفة من قبل المستخدم. اقتران هذا البروتوكول مع المقايسات الكيميائية الحيوية تكشف عن أن شحنات الأحماض الدهنية تغير بشكل كبير من القدرة الحرارية والمقاومة البروتيوليك من Bla g 1 ، مع آثار المصب لمعدل توليد الظهارة T-الخلية وحساسية. تسلط هذه النتائج الضوء على أهمية بروتوكولات إزالة/إعادة تحميل الدهون مثل تلك الموصوفة هنا عند دراسة مسببات الحساسية من المصادر الطبيعية والمتلفة على حد سواء. البروتوكول قابل للتعميم على العائلات المسببة للحساسية الأخرى بما في ذلك lipocalins (Mus m 1) و PR-10 (Bet v 1) و MD-2 (Der p 2) و Uteroglobin (Fel d 1) ، مما يوفر أداة قيمة لدراسة دور الدهون في الاستجابة التحسسية.
Introduction
كشف مسح لقاعدة بيانات مسببات الحساسية أن مسببات الحساسية موجودة في 2٪ فقط من جميع عائلات البروتين المعروفة ، مما يشير إلى أن الخصائص الوظيفية والفيزيائية الحيوية الشائعة تساهم في مسببات الحساسية1. ومن بين هذه الخصائص، يبدو أن القدرة على ربط شحنات الدهون ممثلة تمثيلا زائدا بقوة بين المواد المسببة للحساسية، مما يشير إلى أن هذه الشحنات قد تؤثر على عملية التوعية1. في الواقع، فقد ثبت أن البرازيل الجوز المسببة للحساسية بير ه 1 يتطلب الإدارة المشتركة مع الدهون الذاتية لتحقيق إمكاناتها توعية كاملة2. هذه الدهون يمكن أن تحفز الجهاز المناعي مباشرة كما يتضح من مسببات الحساسية العث دير p 2 و Der p 7، وكلاهما يشترك في الأوهام الهيكلية القوية مع البروتينات LPS ملزمة3،4،5. وبناء على هذه الملاحظة اقترح أن ديرب 2 ودير ص 7 يمكن ربط الدهون البكتيرية وتحفيز مباشرة الجهاز المناعي المضيف من خلال الإشارات بوساطة TLR4، وتسهيل عملية التوعية5،6. من الممكن أيضا أن الدهون المربوطة داخليا يمكن أن تغير الخصائص الفيزيائية الحيوية للبروتينات المسببة للحساسية نفسها. على سبيل المثال، فإن قدرة الخطيئة A 2 (الخردل) وأرا ح 1 (الفول السوداني) للتفاعل مع الحويصلات فوسفولبيد عززت بشكل كبير مقاومتها لتدهور المعدة والإندوسومالي7،في حين أن الربط ليغاند لمسببات الحساسية الرئيسية لحبوب اللقاح البتولا Bet v 1 غيرت كل من معدل المعالجة الإندوسولية وتنوع الببتيداتالناتجة 8. وهذا أمر وثيق الصلة بشكل خاص بحساسية الحساسية نظرا للارتباط الذي لوحظ بين الاستقرار وتوليد الخلايا التائية وحساسية البروتينات مثل Bet v 1 و Bla g 1؛ هذا الأخير الذي سيكون موضوع هذا العمل9،10.
Bla g 1 يمثل العضو النموذجي لعائلة بروتين الحشرات الرئيسية المسببة للحساسية (MA) ، ويمتلك بنية فريدة تتكون من 12 هليس ألفا البرمائي الذي يحيط تجويف مسعور كبير بشكل غير طبيعي9،11. يظهر الهيكل البلوري للأشعة السينية المتوفر في Bla g 1 كثافة الإلكترون داخل هذا التجويف بما يتفق مع الفوسفوليبيدات المنضمة أو الأحماض الدهنية. تخمين أكده 31P-NMR وقياس الطيف الكتلي. وكانت هذه الشحنات غير متجانسة في طبيعتها وكان تكوينها يعتمد بشكل كبير على مصدر مسببات الحساسية ، مع ملامح الدهون المختلفة لوحظت للمتلف Bla g 1 أعرب عنها في E. coli و P. pastoris. الغريب أن Bla g 1 المنقى من مصدر مسببات الحساسية الطبيعية (الصرصور frass) يحتوي على أحماض دهنية في الغالب داخل موقعه الملزم ، مع مزيج من البالميتات والأوليات والستيرات التي يتم تحديدها على أنها ليغندس “طبيعي”9،11. قدرة Bla g 1 على الاحتفاظ بالدهون والأحماض الدهنية بعد خطوات تنقية متعددة تعيق الجهود المبذولة لدراسة البروتين في عزلة. على العكس من ذلك ، فقد اقترح أن palmitate الطبيعية ، stearate ، وlyg ligands oleate من Bla g 1 (يشار إليها من الآن فصاعدا باسم nMix) تلعب دورا رئيسيا في كل من الحساسية والوظيفة البيولوجيةالأصلية 9. ومع ذلك، هذه الليجاند غير موجودة في Bla g 1 التي تم الحصول عليها من مصادر مؤتلفة، مما يجعل من الصعب تقييم هذه الفرضية. وقد لوحظت قضايا مماثلة لغيرها من المواد المسببة للحساسية ملزمة الدهون مثل بيت ضد 112،13. لتسهيل الدراسة المنهجية للتفاعلات الدهون المسببة للحساسية وضعنا بروتوكولا يمكن من خلاله تجريد المواد المسببة للحساسية كميا من الدهون المرتبطة بها وإعادة تشكيلها إما في شكل آبو أو تحميلها مع ليغاندس محددة.
يتم تنقية مسببات الحساسية الأكثر شيوعا من مصادرها الطبيعية أو المؤتلفة باستخدام الكروماتوغرافيا المتقاربة و / أو الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. هنا ، نقدم خطوة تنقية إضافية في شكل كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) تستخدم عمود C18 في المرحلة العكسية التي يتم من خلالها تحويل مسببات الحساسية إلى مذيب عضوي مشابه للبروتوكولات المطورة للبروتينات الملزمة للأحماض الدهنية14. ثم يتعرض البروتين الناتج لخطوة التلين الحراري في غياب أو وجود الأحماض الدهنية و / أو فوسفوليبيدات. بالإضافة إلى استعادة الأصلي Bla g 1 أضعاف, ارتفاع درجات الحرارة زيادة قابلية الذوبان وسهولة الوصول للشحنات الدهون, تسفر عن Bla g 1 إما في شكل أبو أو محملة بشكل موحد مع ليغاند الكاره للماء المطلوب. 31 أكدت أطياف P-NMR من Bla g 1 المنقى بهذه الطريقة الإزالة الكاملة للليجانات المربوطة داخليا والاستبدال الموحد بالمركبات المطلوبة ، في حين أكدت الديسكروزم الدائرية الانتعاش الناجح لأضعاف Bla g 1. يتم تسليط الضوء على فائدة هذه الطريقة في عمل حديث تم العثور فيه على ربط البضائع لتعزيز Bla g 1 thermostability والمقاومة البروتيوليكية ، وتغيير حركية توليد الصرع بالخلايا التائية مع الآثار المحتملة على التوعية وحساسية9.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تطبيق البروتوكول الموصوف في هذا العمل بنجاح لدراسة خصائص ربط الدهون بشكل منهجي من Bla g 1. وكشف هذا عن وجود علاقة بين ربط البضائع ، والترمسة ، والمعالجة الاندوسومالية ، وهذا الأخير كان مرتبطا بانخفاض في توليد epitope الخلايا التائية المعروفة مع الآثار المحتملة على المناعة9،</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر الدكتور توم كيربي وسكوت غابل والدكتور روبرت لندن على مساعدتهم ومساعدتهم طوال هذا العمل، إلى جانب الدكتور بوب بتروفيتش ولوري إدواردز على استخدام أدواتهم ومساعدتهم في توليد بنى Bla g 1 المستخدمة في هذه الدراسة. نشكر أندريا آدامز على المساعدة في قياس الطيف الكتلي، والدكتور يوجين ديروس للمساعدة في أجهزة NMR. تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث داخل العين من المعاهد القومية للصحة، المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية، Z01-ES102906 (GAM). المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية.
Materials
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe – a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250×10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
- Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
- Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
- Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
- Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
- Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
- Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
- Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
- Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
- Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
- Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
- Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
- Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
- Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. 생화학. 24 (15), 3821-3826 (1985).
- Delaglio, F., et al. Nmrpipe – a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
- Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
- Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
- Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
- Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
- Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
- Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
- Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
- Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
- Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
- Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
- Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
- Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
- Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
- Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
- Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
- de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
- Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
- Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
- Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).
