Fjernelse og udskiftning af endogene ligands fra Lipid-Bound Proteiner og allergener
Summary
Denne protokol beskriver fjernelsen af endogene lipider fra allergener og deres erstatning med brugerspecifikke ligands gennem omvendt fase HPLC kombineret med termisk udglødning. 31 år P-NMR og cirkulær dichroism giver mulighed for hurtig bekræftelse af ligand fjernelse / lastning, og inddrivelse af indfødte allergen struktur.
Abstract
Mange større allergener binder sig til hydrofobe lipidlignende molekyler, herunder Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 og Fel d 1. Disse ligands er stærkt bevaret og har potentiale til at påvirke sensibiliseringsprocessen enten ved direkte at stimulere immunsystemet eller ændre de biofysiske egenskaber af det allergifremkaldende protein. For at kunne kontrollere for disse variabler kræves der teknikker til fjernelse af endogene bundne ligands og om nødvendigt udskiftning med lipider af kendt sammensætning. Kakerlakallergeneret Bla g 1 omslutter et stort hydrofobisk hulrum, der binder en heterogen blanding af endogene lipider, når de renses ved hjælp af traditionelle teknikker. Her beskriver vi en metode, hvorigennem disse lipider fjernes ved hjælp af omvendt fase HPLC efterfulgt af termisk udglødning for at give Bla g 1 i enten sin Apo-form eller genindlæses med en brugerdefineret blanding af fedtsyrer eller fosforlastningslaster. Koblingen af denne protokol med biokemiske assays viser, at fedtsyrelaster i væsentlig grad ændrer termo ustabiliteten og proteolytisk resistens hos Bla g 1 med nedstrømsvirkninger for satsen for T-celle epitopdannelse og allergenicitet. Disse resultater fremhæver vigtigheden af lipid fjernelse / ladning protokoller som den, der er beskrevet heri, når de studerer allergener fra både rekombinant og naturlige kilder. Protokollen er generaliserbar for andre allergen familier, herunder lipocalins (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) og Uteroglobin (Fel d 1), hvilket giver et værdifuldt redskab til at studere lipiders rolle i den allergiske reaktion.
Introduction
En undersøgelse af allergendatabasen afslører, at allergener findes i kun 2% af alle kendte proteinfamilier, hvilket tyder på, at almindelige funktionelle og biofysiske egenskaber bidrager til allergenicitet1. Af disse egenskaber synes evnen til at binde lipidfragter at være stærkt overrepræsenteret blandt allergener, hvilket tyder på, at disse laster kan påvirke sensibiliseringsprocessen1. Faktisk har det vist sig, at Brasilien Nut allergen Ber e 1 kræver co-administration med sin endogene lipid at realisere sin fulde sensibilisere potentiale2. Disse lipider kan potentielt stimulere immunsystemet direkte som illustreret af mide allergener Der p 2 og Der p 7, som begge deler en stærk strukturel homologi med LPS-bindende proteiner3,4,5. Baseret på denne observation blev det foreslået, at Derp 2 og Der p 7 kunne binde bakterielle lipider og direkte stimulere værts immunsystemet gennem TLR4-medieret signalering, hvilket letter sensibiliseringsprocessen5,6. Det er også muligt, at endogene bundet lipider kunne ændre de biofysiske egenskaber af allergifremkaldende proteiner selv. For eksempel forbedrede Sin a 2 (sennep) og Ara h 1 (jordnødder) evne til at interagere med fosfor vesikler betydeligt deres modstand mod gastrisk og endosomal nedbrydning7, mens ligand binding til det store birk pollenallergener Bet v 1 ændrede både hastigheden af endosomal behandling og mangfoldigheden af de resulterende peptider8. Dette er især relevant for allergenicitet i betragtning af den korrelation, der er observeret mellem stabilitet, T-celle epitop generation og allergenicitet for proteiner som Bet v 1 og Bla g 1; sidstnævnte vil blive genstand for dette arbejde9,10.
Bla g 1 repræsenterer det prototypiske medlem af insektet Major Allergen (MA) proteinfamilie og har en unik struktur bestående af 12 amfipatiske alfabæger, der omslutter et unormalt stort hydrofobisk hulrum9,11. Den tilgængelige røntgenkrystalstruktur i Bla g 1 viser elektrontætheden inden for dette hulrum i overensstemmelse med bundne fosfor- eller fedtsyreligler; en formodning bekræftet af 31P-NMR og massespektrometri. Disse laster var heterogene i naturen, og deres sammensætning var stærkt afhængig af allergenkilden, med forskellige lipidprofiler observeret for rekombinant Bla g 1 udtrykt i E. coli og P. pastoris. Mærkeligt nok indeholdt Bla g 1 renset fra sin naturlige allergenkilde (kakerlak frass) overvejende fedtsyrer inden for dets bindende sted, med en blanding af palmitate, oleat og stearit identificeret som dets “naturlige” ligands9,11. Bla g 1’s evne til at fastholde lipider og fedtsyrer efter flere rensningstrin hindrer bestræbelserne på at studere proteinet isoleret. Omvendt er det blevet foreslået, at den naturlige palmitate, stearit, og oleate ligands af Bla g 1 (fremover benævnt nMix) spiller en central rolle i både dens allergenicitet og indfødte biologiske funktion9. Disse ligands er imidlertid ikke til stede i Bla g 1 fra rekombinant kilder, hvilket gør det vanskeligt at vurdere denne hypotese. Lignende problemer er blevet observeret for andre lipidbinding allergener såsom Bet v 112,13. For at lette den systematiske undersøgelse af lipid-allergen interaktioner har vi udviklet en protokol, hvorigennem allergener kan kvantitativt fratages deres endogene bundet lipider og rekonstitueres i enten Apo-form eller fyldt med specifikke ligands.
Allergener er oftest renset fra deres naturlige eller rekombinante kilder ved hjælp af affinitet kromatografi og / eller størrelse-udelukkelse kromatografi. Her introducerer vi et ekstra rensningstrin i form af højtydende væskekromatografi (HPLC), der anvender en omvendt fase C18-kolonne, hvorfra allergenet er udråbt til et organisk opløsningsmiddel svarende til protokoller udviklet til fedtsyrebindingsproteiner14. Det resulterende protein udsættes derefter for et termisk udglødningstrin i mangel af eller tilstedeværelse af fedtsyrer og/eller fosfolipider. Ud over at genvinde den oprindelige Bla g 1 fold, øger de forhøjede temperaturer opløseligheden og tilgængeligheden af lipidlasterne, hvilket giver Bla g 1 i enten Apo-formen eller ensartet fyldt med den ønskede hydrofobe ligand. 31 år P-NMR spektre af Bla g 1 renset på denne måde bekræftede fuldstændig fjernelse af endogene bundet ligands og ensartet udskiftning med de ønskede forbindelser, mens cirkulær dichroism bekræftede en vellykket inddrivelse af Bla g 1 fold. Nytten af denne metode er fremhævet i et nyligt arbejde, hvor lastbinding blev fundet for at forbedre Bla g 1 termo ustabilitet og proteolytisk modstand, ændre kinetik af T-celle epitop generation med potentielle konsekvenser for sensibilisering og allergenicitet9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den protokol, der er beskrevet i dette arbejde, er blevet anvendt til systematisk at undersøge Bla g 1’s lipidbindingsegenskaber. Dette afslørede en sammenhæng mellem lastbinding, termo ustabilitet og endosomal behandling, hvoraf sidstnævnte var korreleret med fald i genereringen af en kendt T-celle epitop med potentielle konsekvenser for immunogenicitet9,18. Ud over Bla g 1 har andre allergener som Pru p 3 og Bet v 1 vist sig at bevare deres endogene laster …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Dr. Tom Kirby, Scott Gabel, og Dr. Robert London for deres hjælp og bistand i hele dette arbejde, sammen med Dr. Bob Petrovich og Lori Edwards for brugen af deres instrumentering og deres bistand til at generere Bla g 1 konstruktioner ansat i denne undersøgelse. Vi takker Andrea Adams for hjælp med massespektrometrien og Dr. Eugene DeRose for hjælp til NMR-instrumenteringen. Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program af NIH, National Institute of Environmental Health Sciences, Z01-ES102906 (GAM). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institute of Environmental Health Sciences.
Materials
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe – a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250×10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
- Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
- Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
- Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
- Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
- Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
- Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
- Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
- Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
- Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
- Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
- Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
- Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
- Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. 생화학. 24 (15), 3821-3826 (1985).
- Delaglio, F., et al. Nmrpipe – a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
- Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
- Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
- Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
- Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
- Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
- Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
- Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
- Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
- Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
- Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
- Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
- Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
- Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
- Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
- Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
- de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
- Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
- Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
- Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).
