Verwijdering en vervanging van endogene liganden uit lipidegebonden eiwitten en allergenen
Summary
Dit protocol beschrijft de verwijdering van endogene lipiden uit allergenen en hun vervanging door door de gebruiker gespecificeerde liganden door middel van omgekeerde fase HPLC in combinatie met thermisch gloeien. 32 P-NMR en circulair dichroïsme zorgen voor een snelle bevestiging van ligandverwijdering/-belasting en het herstel van de inheemse allergenenstructuur.
Abstract
Veel belangrijke allergenen binden zich aan hydrofobe lipide-achtige moleculen, waaronder Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 en Fel d 1. Deze liganden worden sterk behouden en hebben het potentieel om het sensibilisatieproces te beïnvloeden, hetzij door het immuunsysteem rechtstreeks te stimuleren of de biofysische eigenschappen van het allergene eiwit te veranderen. Om deze variabelen te controleren, zijn technieken nodig voor het verwijderen van endogene liganden en, indien nodig, vervanging door lipiden van bekende samenstelling. Het kakkerlakallergeen Bla g 1 omsluit een grote hydrofobe holte die een heterogeen mengsel van endogene lipiden bindt wanneer het wordt gezuiverd met behulp van traditionele technieken. Hier beschrijven we een methode waarmee deze lipiden worden verwijderd met behulp van omgekeerde fase HPLC, gevolgd door thermisch gloeien om Bla g 1 in zijn Apo-vorm op te leveren of opnieuw geladen met een door de gebruiker gedefinieerd mengsel van vetzuur of fosfolipide ladingen. Door dit protocol te koppelen aan biochemische assays blijkt dat vetzuurladingen de thermostabiliteit en proteolytische resistentie van Bla g 1 aanzienlijk veranderen, met downstream implicaties voor de snelheid van T-cel epitoopgeneratie en allergeniciteit. Deze resultaten benadrukken het belang van lipidenverwijderings-/herlaadprotocollen zoals hierin beschreven bij het bestuderen van allergenen uit zowel recombinante als natuurlijke bronnen. Het protocol is generaliseerbaar voor andere allergenenfamilies, waaronder lipocalines (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) en Uteroglobin (Fel d 1), en biedt een waardevol hulpmiddel om de rol van lipiden in de allergische reactie te bestuderen.
Introduction
Een onderzoek van de allergenendatabase toont aan dat allergenen worden gevonden in slechts 2% van alle bekende eiwitfamilies, wat suggereert dat gemeenschappelijke functionele en biofysische eigenschappen bijdragen aan allergeniciteit1. Van deze eigenschappen lijkt het vermogen om lipideladingen te binden sterk oververtegenwoordigd te zijn onder allergenen, wat suggereert dat deze ladingen het sensibilisatieproces kunnen beïnvloeden1. Het is inderdaad aangetoond dat het ParaNoot allergeen Ber e 1 co-toediening met zijn endogene lipide vereist om zijn volledige sensibiliserende potentieel te realiseren2. Deze lipiden kunnen het immuunsysteem mogelijk direct stimuleren, zoals blijkt uit de mijtallergenen Der p 2 en Der p 7, die beide een sterke structurele homologie delen met LPS-bindende eiwitten3,4,5. Op basis van deze observatie werd voorgesteld dat Derp 2 en Der p 7 bacteriële lipiden konden binden en het immuunsysteem van de gastheer rechtstreeks konden stimuleren door middel van TLR4-gemedieerde signalering, waardoor het sensibilisatieproces5,6werdvergemakkelijkt . Het is ook mogelijk dat endogene gebonden lipiden de biofysische eigenschappen van allergene eiwitten zelf kunnen veranderen. Bijvoorbeeld, het vermogen van Sin a 2 (mosterd) en Ara h 1 (pinda’s) om te interageren met fosfolipide blaasjes aanzienlijk verbeterd hun weerstand tegen maag- en endosomale afbraak7, terwijl ligand binding aan de belangrijkste berkenpollen allergeen Bet v 1 veranderde zowel de snelheid van endosomale verwerking en de diversiteit van de resulterende peptiden8. Dit is met name relevant voor allergeniciteit gezien de correlatie die is waargenomen tussen stabiliteit, T-cel epitoopgeneratie en allergeniciteit voor eiwitten zoals Bet v 1 en Bla g 1; waarvan deze laatste het onderwerp zullen zijn van deze werkzaamheden9,10.
Bla g 1 vertegenwoordigt het prototypische lid van de insecten major allergene (MA) eiwitfamilie, en bezit een unieke structuur bestaande uit 12 amphipathische alfa helices die een abnormaal grote hydrofobeholteomsluiten 9,11. De beschikbare röntgenkristalstructuur van Bla g 1 toont de elektronendichtheid in deze holte die overeenkomt met gebonden fosfolipide of vetzuur liganden; een vermoeden bevestigd door 31P-NMR en massaspectrometrie. Deze ladingen waren heterogeen van aard en hun samenstelling was sterk afhankelijk van de allergene bron, met verschillende lipidenprofielen waargenomen voor recombinant Bla g 1 uitgedrukt in E. coli en P. pastoris. Merkwaardig genoeg bevatte Bla g 1 gezuiverd uit zijn natuurlijke allergene bron (kakkerlak frass) voornamelijk vetzuren binnen zijn bindingsplaats, waarbij een mengsel van palmitaat, oleaat en stearaat werd geïdentificeerd als zijn “natuurlijke” liganden9,11. Het vermogen van Bla g 1 om lipiden en vetzuren te behouden na meerdere zuiveringsstappen belemmert de inspanningen om het eiwit afzonderlijk te bestuderen. Omgekeerd is gesuggereerd dat de natuurlijke palmitaat, stearaat en oleaat liganden van Bla g 1 (voortaan aangeduid als nMix) een sleutelrol spelen in zowel de allergeniciteit als de inheemse biologische functie9. Deze liganden zijn echter niet aanwezig in Bla g 1 verkregen uit recombinante bronnen, waardoor het moeilijk is om deze hypothese te beoordelen. Soortgelijke problemen zijn waargenomen voor andere lipidebindende allergenen zoals Bet v 112,13. Om de systematische studie van lipiden-allergeneninteracties te vergemakkelijken, hebben we een protocol ontwikkeld waarmee allergenen kwantitatief kunnen worden ontdaan van hun endogene gebonden lipiden en kunnen worden gereconstitueerd in Apo-vorm of geladen met specifieke liganden.
Allergenen worden meestal gezuiverd uit hun natuurlijke of recombinante bronnen met behulp van affiniteitschromatografie en/of grootte-uitsluitingschromatografie. Hier introduceren we een extra zuiveringsstap in de vorm van hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) met behulp van een omgekeerde fase C18-kolom waaruit het allergeen wordt geëuteerd tot een organisch oplosmiddel vergelijkbaar met protocollen ontwikkeld voor vetzuurbindende eiwitten14. Het resulterende eiwit wordt vervolgens onderworpen aan een thermische gloeistap bij afwezigheid of aanwezigheid van vetzuren en/of fosfolipiden. Naast het herstellen van de inheemse Bla g 1-vouw, verhogen de verhoogde temperaturen de oplosbaarheid en toegankelijkheid van de lipideladingen, waardoor Bla g 1 in de Apo-vorm wordt opgeleverd of gelijkmatig wordt geladen met de gewenste hydrofobe ligand. 32 P-NMR spectra van Bla g 1 op deze manier gezuiverd bevestigden de volledige verwijdering van endogene gebonden liganden en uniforme vervanging door de gewenste verbindingen, terwijl circulair dichroïsme het succesvolle herstel van de Bla g 1-vouw bevestigde. Het nut van deze methode wordt benadrukt in een recent werk waarin ladingbinding werd gevonden om Bla g 1 thermostabiliteit en proteolytische weerstand te verbeteren, waardoor de kinetiek van T-cel epitoopgeneratie werd gewijzigd met mogelijke implicaties voor sensibilisatie en allergeniciteit9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het in dit werk beschreven protocol is met succes toegepast om systematisch de lipidenbindende eigenschappen van Bla g 1 te bestuderen. Hieruit bleek een correlatie tussen ladingbinding, thermostabiliteit en endosomale verwerking, waarvan de laatste gecorreleerd was met een afname van de productie van een bekende T-celeptoop met mogelijke implicaties voor immunogeniciteit9,18. Naast Bla g 1 is aangetoond dat andere allergenen zoals Pru p 3 en Bet v 1 hun endogene…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Dr. Tom Kirby, Scott Gabel en Dr. Robert London bedanken voor hun hulp en bijstand tijdens dit werk, samen met Dr. Bob Petrovich en Lori Edwards voor het gebruik van hun instrumentatie en hun hulp bij het genereren van de Bla g 1-constructies die in deze studie worden gebruikt. We danken Andrea Adams voor hulp bij de massaspectrometrie en Dr. Eugene DeRose voor hulp bij de NMR-instrumentatie. Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramuraal Onderzoeksprogramma van het NIH, National Institute of Environmental Health Sciences, Z01-ES102906 (GAM). De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van het National Institute of Environmental Health Sciences.
Materials
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe – a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250×10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
- Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
- Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
- Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
- Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
- Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
- Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
- Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
- Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
- Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
- Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
- Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
- Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
- Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. 생화학. 24 (15), 3821-3826 (1985).
- Delaglio, F., et al. Nmrpipe – a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
- Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
- Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
- Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
- Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
- Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
- Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
- Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
- Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
- Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
- Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
- Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
- Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
- Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
- Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
- Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
- de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
- Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
- Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
- Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).
