Élimination et remplacement des ligands endogènes des protéines et allergènes liés aux lipides

Summary

Ce protocole décrit le déplacement des lipides endogènes des allergènes, et leur remplacement par les ligands utilisateur-spécifiés par HPLC de reverse-phase couplé avec le recuit thermique. ^{31 ans} La RMN-P et le dichroïsme circulaire permettent la confirmation rapide de l’élimination/chargement des ligands et la récupération de la structure allergène native.

Abstract

De nombreux allergènes majeurs se lient à des molécules hydrophobes de type lipidique, y compris Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 et Fel d 1. Ces ligands sont fortement retenus et ont le potentiel d’influencer le processus de sensibilisation soit en stimulant directement le système immunitaire, soit en modifiant les propriétés biophysiques de la protéine allergène. Afin de contrôler ces variables, des techniques sont nécessaires pour l’élimination des ligands liés de manière endogène et, si nécessaire, leur remplacement par des lipides de composition connue. L’allergène cafard Bla g 1 renferme une grande cavité hydrophobe qui lie un mélange hétérogène de lipides endogènes lorsqu’il est purifié à l’aide de techniques traditionnelles. Ici, nous décrivons une méthode par laquelle ces lipides sont éliminés à l’aide de la CLHP en phase inverse suivie d’un recuit thermique pour donner Bla g 1 sous sa forme Apo ou rechargée avec un mélange défini par l’utilisateur de cargaisons d’acides gras ou de phospholipides. Le couplage de ce protocole avec des analyses biochimiques indique que les cargaisons d’acides gras modifient de manière significative la thermostabilité et la résistance protéolytique de Bla g 1, avec des implications en aval pour le taux de génération d’épitope à cellule T et d’allergénicité. Ces résultats soulignent l’importance des protocoles d’élimination/rechargement des lipides tels que celui décrit ici lors de l’étude des allergènes provenant de sources recombinantes et naturelles. Le protocole est généralisable à d’autres familles d’allergènes comprenant les lipocalines (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) et uteroglobin (Fel d 1), fournissant un outil précieux pour étudier le rôle des lipides dans la réponse allergique.

Introduction

Une enquête de la base de données sur les allergènes révèle que les allergènes ne se trouvent que dans 2% de toutes les familles de protéines connues, ce qui suggère que les propriétés fonctionnelles et biophysiques communes contribuent à l’allergénicité^1. Parmi ces propriétés, la capacité de lier les cargaisons lipidiques semble être fortement surreprésentée parmi les allergènes, ce qui suggère que ces cargaisons peuvent influencer le processus de sensibilisation^1. En effet, il a été démontré que l’allergène de noix du Brésil Ber e 1 nécessite une co-administration avec son lipide endogène pour réaliser son plein potentiel sensibilisant^2. Ces lipides pourraient potentiellement stimuler directement le système immunitaire comme l’illustrent les allergènes acariens Der p2 et Der p7, qui partagent tous deux une forte homologie structurelle avec les protéines liant les LPS^3,4,5. Sur la base de cette observation, il a été proposé que Derp 2 et Der p 7 puissent lier les lipides bactériens et stimuler directement le système immunitaire de l’hôte grâce à la signalisation médiée par TLR4, facilitant le processus de sensibilisation^5,6. Il est également possible que les lipides liés de manière endogène puissent modifier les propriétés biophysiques des protéines allergènes elles-mêmes. Par exemple, la capacité de Sin a 2 (moutarde) et d’Ara h1 (arachides) à interagir avec les vésicules phospholipidiques a considérablement amélioré leur résistance à la dégradation gastrique et endosomal^7,tandis que la liaison du ligand au principal allergène de pollen de bouleau Bet v1 a altéré à la fois le taux de traitement endosomal et la diversité des peptides résultants^8. Ceci est particulièrement pertinent pour l’allergénicité étant donné la corrélation qui a été observée entre la stabilité, la génération d’épitopes des lymphocytes T et l’allergénicité pour des protéines telles que Bet v 1 et Bla g 1; ce dernier faisant l’objet de ces travaux^9,10.

Bla g1 représente le membre prototypique de la famille des protéines allergènes majeures (MA) des insectes, et possède une structure unique composée de 12 hélices alpha amphipathiques qui entourent une cavité hydrophobe anormalement grande^9,11. La structure cristalline à rayons X disponible de Bla g1 montre la densité électronique dans cette cavité compatible avec les ligands liés aux phospholipides ou aux acides gras; une conjecture confirmée par ³¹P-RMN et spectrométrie de masse. Ces cargaisons étaient de nature hétérogène et leur composition dépendait fortement de la source de l’allergène, avec différents profils lipidiques observés pour le Bla g1 recombinant exprimé en E. coli et P. pastoris. Curieusement, Bla g1 purifié de sa source naturelle d’allergènes (cafard frass) contenait principalement des acides gras dans son site de liaison, avec un mélange de palmitate, d’oléate et de stéarate étant identifié comme ses ligands « naturels »^9,11. La capacité de Bla g 1 à retenir les lipides et les acides gras après de multiples étapes de purification entrave les efforts pour étudier la protéine de manière isolée. A l’inverse, il a été suggéré que les ligands naturels palmitate, stéarate, et oléate de Bla g1 (ci-après dénommés nMix) jouent un rôle clé à la fois dans son allergénicité et dans sa fonction biologique native^9. Cependant, ces ligands ne sont pas présents dans Bla g1 obtenu à partir de sources recombinantes, ce qui rend difficile l’évaluation de cette hypothèse. Des problèmes similaires ont été observés pour d’autres allergènes de liaison aux lipides tels que Bet v^{1 12,13.} Pour faciliter l’étude systématique des interactions lipide-allergène, nous avons développé un protocole par lequel les allergènes peuvent être quantitativement dépouillés de leurs lipides liés de manière endogène et reconstitués sous forme apo ou chargés de ligands spécifiques.

Les allergènes sont le plus souvent purifiés à partir de leurs sources naturelles ou recombinantes à l’aide de la chromatographie d’affinité et/ou de la chromatographie d’exclusion de taille. Ici, nous introduisons une étape de purification supplémentaire sous la forme d’une chromatographie liquide haute performance (CLHP) utilisant une colonne C18 en phase inverse à partir de laquelle l’allergène est élué dans un solvant organique similaire aux protocoles développés pour les protéines de liaison aux acides gras^14. La protéine résultante est ensuite soumise à une étape de recuit thermique en l’absence ou la présence d’acides gras et/ou de phospholipides. En plus de récupérer le pli natif Bla g 1, les températures élevées augmentent la solubilité et l’accessibilité des cargaisons lipidiques, donnant Bla g 1 sous forme Apo ou uniformément chargé avec le ligand hydrophobe souhaité. ^{31 ans} Les spectres RMN de Bla g 1 purifiés de cette manière ont confirmé le déplacement complet des ligands endogènement liés et le remplacement uniforme avec les composés désirés, alors que le dichroïsme circulaire confirmait le rétablissement réussi du pli bla g 1. L’utilité de cette méthode est mise en évidence dans un travail récent dans lequel la liaison de cargaison s’est avérée améliorer la thermostabilité bla g1 et la résistance protéolytique, modifiant la cinétique de la génération d’épitopes des lymphocytes T avec des implications potentielles pour la sensibilisation et l’allergénicité^9.

Protocol

1. Clonage Bla g 1 Obtenir le gène de l’allergène blatte Bla g 1.0101 (résidus 34-216), représentant une seule répétition du domaine MA. Par souci de simplicité, Bla g 1 sera utilisé tout au long de l’œuvre pour représenter cette répétition unique, plutôt que l’intégralité de la transcription Bla g 1.0101. Subclone le gène Bla g 1 dans le vecteur désiré. Dans cette étude, le gène contenant une étiquette de S-transférase de glutathion N-terminale (GST) coupl…

Representative Results

En utilisant la chromatographie d’affinité, le GST-Bla g 1 recombinant a été facilement isolé à un niveau élevé de pureté (Figure 1A), produisant un rendement d’environ 2–4 mg/L de culture cellulaire. L’incubation pendant la nuit avec de la PROTÉASE TEV à 4 °C est suffisante pour enlever l’étiquette GST, ce qui donne le produit final à ~24 kDa. Notez que dans ce cas, il y a une quantité importante de GST-Bla g 1 dans les fractions de flux et de lavage, ce qui suggère que la capac…

Discussion

Le protocole décrit dans ce travail a été appliqué avec succès pour étudier systématiquement les propriétés de liaison lipidique de Bla g1. Ceci a révélé une corrélation entre la liaison de la cargaison, la thermostabilité, et le traitement endosomal, ce dernier étant corrélé avec la diminution de la génération d’un épitope à cellule T connu avec des implications potentielles pour l’immunogénicité^9,18. En plus de Bla g1, il a été dém…

Materials

Bla g 1 Gene	Genescript	N/a	Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216
Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1)	Indoor biotechnologies	N/a	Custom order
Agilent 1100 Series HPLC System	Agilent	G1315B, G1311A, G1322A	UV Detector, Pump, and Degasser
Agilent DD2 600 MHz spectrometer	Agilent	N/a
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Amicon	UFC-1008
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
Benzonase	Sigma-Aldrich	E1014-5KU
Broad- band 5 mm Z-gradient probe	Varian	N/a
ChemStation for LC (Software)	Agilent	N/a
cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC)	Avanti Polar Lipids	850365C
E. Coli BL21 DE3 Cells	New England Biolabs	C2530H
Freezone 4.5 Freeze Dry System	Labconco	7750000
Glutathione Resin	Genescript	L00206
Glutathione, Reduced	Fisher Scientific	BP25211
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Fisher Scientific	34060
Jasco  CD spectropolarimeter	Jasco	J-815
Millex Syringe Filter Unit	EMD Millipore	SLGS033SS
NMRPipe (Software)	Delaglio et al.	N/a	Delaglio, F. et al. Nmrpipe – a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995).
NMRViewJ (Software)	Johnson et al.	N/a	Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994).
Oleic acid	Sigma-Aldrich	O1008
Pierce BCA Protein Assay	Sigma-Aldrich	BCA1-1KT
Polaris 5 C18-A 250×10.0 mm HPLC Column	Agilent	SKU: A2000250X100
SD-200 Vacuum Pump	Varian	VP-195
Sodium Cholate Hydrate	Sigma-Aldrich	C6445
Sodium Palmitate	Sigma-Aldrich	P9767
Sodium Stearate	Sigma-Aldrich	S3381
VnmrJ (Software)	Varian	N/a