Entfernung und Ersatz endogener Liganden aus lipidgebundenen Proteinen und Allergenen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Entfernung endogener Lipide aus Allergenen und deren Ersatz durch benutzerdefinierte Liganden durch Umkehrphasen-HPLC in Verbindung mit thermischem Glühen. 31 P-NMR und zirkulärer Dichroismus ermöglichen die schnelle Bestätigung der Ligandenentfernung/-belastung und die Wiederherstellung der nativen Allergenstruktur.
Abstract
Viele wichtige Allergene binden an hydrophobe lipidähnliche Moleküle, darunter Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 und Fel d 1. Diese Liganden bleiben stark erhalten und haben das Potenzial, den Sensibilisierungsprozess zu beeinflussen, entweder durch direkte Stimulation des Immunsystems oder durch Veränderung der biophysikalischen Eigenschaften des allergenen Proteins. Um diese Variablen zu kontrollieren, sind Techniken zur Entfernung endogener gebundener Liganden und gegebenenfalls zum Ersatz durch Lipide bekannter Zusammensetzung erforderlich. Das Kakerlakenallergen Bla g 1 umschließt eine große hydrophobe Höhle, die eine heterogene Mischung aus endogenen Lipiden bindet, wenn sie mit traditionellen Techniken gereinigt wird. Hier beschreiben wir eine Methode, mit der diese Lipide mittels Umkehrphasen-HPLC gefolgt von thermischem Glühen entfernt werden, um Bla g 1 entweder in seiner Apo-Form oder mit einer benutzerdefinierten Mischung aus Fettsäure- oder Phospholipidladungen zu erhalten. Die Kopplung dieses Protokolls mit biochemischen Assays zeigt, dass Fettsäureladungen die Thermostabilität und proteolytische Resistenz von Bla g 1 signifikant verändern, mit nachgelagerten Auswirkungen auf die Rate der T-Zell-Epitopbildung und Allergenität. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von Lipidentfernungs- / Nachladeprotokollen wie dem hier beschriebenen bei der Untersuchung von Allergenen aus rekombinanten und natürlichen Quellen. Das Protokoll ist auf andere Allergenfamilien verallgemeinerbar, einschließlich Lipocaline (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) und Uteroglobin (Fel d 1), und bietet ein wertvolles Werkzeug, um die Rolle von Lipiden bei der allergischen Reaktion zu untersuchen.
Introduction
Eine Untersuchung der Allergendatenbank zeigt, dass Allergene nur in 2% aller bekannten Proteinfamilien vorkommen, was darauf hindeutet, dass gemeinsame funktionelle und biophysikalische Eigenschaften zur Allergenität beitragen1. Von diesen Eigenschaften scheint die Fähigkeit, Lipidladungen zu binden, unter allergenen stark überrepräsentiert zu sein, was darauf hindeutet, dass diese Ladungen den Sensibilisierungsprozess beeinflussen können1. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass das Paranussallergen Ber e 1 eine gleichzeitige Verabreichung mit seinem endogenen Lipid erfordert, um sein volles sensibilisierendes Potenzialauszuschöpfen 2. Diese Lipide könnten potentiell das Immunsystem direkt stimulieren, wie die Milbenallergene Der p 2 und Der p 7 zeigen, die beide eine starke strukturelle Homologie mit LPS-bindenden Proteinen3,4,5teilen . Basierend auf dieser Beobachtung wurde vorgeschlagen, dass Derp 2 und Der p 7 bakterielle Lipide binden und das Immunsystem des Wirts durch TLR4-vermittelte Signalisierung direkt stimulieren könnten, was den Sensibilisierungsprozess erleichtert5,6. Es ist auch möglich, dass endogen gebundene Lipide die biophysikalischen Eigenschaften allergener Proteine selbst verändern könnten. Zum Beispiel erhöhte die Fähigkeit von Sin a 2 (Senf) und Ara h 1 (Erdnüsse), mit Phospholipidvesikeln zu interagieren, signifikant ihre Resistenz gegen Magen- und Endosomalabbau7, während die Ligandenbindung an das Hauptbirkenpollenallergen Bet v 1 sowohl die Rate der endosomalen Verarbeitung als auch die Vielfalt der resultierenden Peptide veränderte8. Dies ist besonders relevant für die Allergenität angesichts der Korrelation, die zwischen Stabilität, T-Zell-Epitopbildung und Allergenität für Proteine wie Bet v 1 und Bla g 1 beobachtet wurde; Letzteres wird Gegenstand dieser Arbeit sein9,10.
Bla g 1 repräsentiert das prototypische Mitglied der Proteinfamilie des Major Allergen (MA) des Insekts und besitzt eine einzigartige Struktur, die aus 12 amphipathischen Alpha-Helices besteht, die einen ungewöhnlich großen hydrophobenHohlraumumschließen 9,11. Die verfügbare Röntgenkristallstruktur von Bla g 1 zeigt eine Elektronendichte innerhalb dieses Hohlraums, die mit gebundenen Phospholipid- oder Fettsäureliganden übereinstimmt; eine Vermutung, die durch 31P-NMR und Massenspektrometrie bestätigt wird. Diese Ladungen waren heterogener Natur und ihre Zusammensetzung hing stark von der Allergenquelle ab, wobei für rekombinante Bla g 1, ausgedrückt in E. coli und P. pastoris,unterschiedliche Lipidprofile beobachtet wurden. Seltsamerweise enthielt Bla g 1, gereinigt von seiner natürlichen Allergenquelle (Kakerlakenfrass), überwiegend Fettsäuren an seiner Bindungsstelle, wobei eine Mischung aus Palmitat, Oleat und Stearat als seine “natürlichen” Liganden identifiziert wurde9,11. Die Fähigkeit von Bla g 1, Lipide und Fettsäuren nach mehreren Reinigungsschritten zurückzuhalten, behindert die Bemühungen, das Protein isoliert zu untersuchen. Umgekehrt wurde vermutet, dass die natürlichen Palmitat-, Stearat- und Oleatliganden von Bla g 1 (im Folgenden als nMix bezeichnet) eine Schlüsselrolle sowohl bei seiner Allergenität als auch bei seiner nativen biologischen Funktion spielen9. Diese Liganden sind jedoch in Bla g 1, die aus rekombinanten Quellen gewonnen wurden, nicht vorhanden, was es schwierig macht, diese Hypothese zu beurteilen. Ähnliche Probleme wurden für andere lipidbindende Allergene wie Bet v 112,13beobachtet. Um die systematische Untersuchung von Lipid-Allergen-Interaktionen zu erleichtern, haben wir ein Protokoll entwickelt, mit dem Allergene quantitativ von ihren endogen gebundenen Lipiden befreit und entweder in Apo-Form rekonstituiert oder mit spezifischen Liganden beladen werden können.
Allergene werden am häufigsten aus ihren natürlichen oder rekombinanten Quellen mittels Affinitätschromatographie und/oder Größenausschlusschromatographie gereinigt. Hier führen wir einen zusätzlichen Reinigungsschritt in Form der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer Umkehrphasen-C18-Säule ein, aus der das Allergen in ein organisches Lösungsmittel eluiert wird, ähnlich den protokollierten Protokollen, die für fettsäurebindende Proteine entwickelt wurden14. Das resultierende Protein wird dann in Abwesenheit oder Gegenwart von Fettsäuren und/oder Phospholipiden einem thermischen Glühschritt unterzogen. Zusätzlich zur Rückgewinnung des nativen Bla g 1-fachen erhöhen die erhöhten Temperaturen die Löslichkeit und Zugänglichkeit der Lipidladungen, wodurch Bla g 1 entweder in apo-Form oder gleichmäßig mit dem gewünschten hydrophoben Liganden beladen wird. 31 P-NMR-Spektren von Bla g 1, die auf diese Weise gereinigt wurden, bestätigten die vollständige Entfernung endogener gebundener Liganden und den gleichmäßigen Ersatz durch die gewünschten Verbindungen, während der zirkuläre Dichroismus die erfolgreiche Wiederherstellung der Bla g 1-Falte bestätigte. Der Nutzen dieser Methode wird in einer kürzlich durchgeführten Arbeit hervorgehoben, in der festgestellt wurde, dass die Ladungsbindung die Thermostabilität und proteolytische Resistenz von Bla g 1 verbessert und die Kinetik der T-Zell-Epitoperzeugung mit potenziellen Auswirkungen auf die Sensibilisierung und Allergenität verändert9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll wurde erfolgreich angewendet, um die Lipidbindungseigenschaften von Bla g 1 systematisch zu untersuchen. Dies zeigte eine Korrelation zwischen Ladungsbindung, Thermostabilität und endosomaler Verarbeitung, von denen letztere mit einer Abnahme der Erzeugung eines bekannten T-Zell-Epitops mit möglichen Auswirkungen auf die Immunogenität korrelierte9,18. Zusätzlich zu Bla g 1 haben andere Allergene wie Pru p 3 und Bet …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Tom Kirby, Scott Gabel und Dr. Robert London für ihre Hilfe und Unterstützung während dieser Arbeit, zusammen mit Dr. Bob Petrovich und Lori Edwards für die Verwendung ihrer Instrumentierung und ihre Unterstützung bei der Erstellung der bla g 1-Konstrukte, die in dieser Studie verwendet werden. Wir danken Andrea Adams für die Unterstützung bei der Massenspektrometrie und Dr. Eugene DeRose für die Unterstützung bei der NMR-Instrumentierung. Diese Forschung wurde vom Intramural Research Program des NIH, National Institute of Environmental Health Sciences, Z01-ES102906 (GAM) unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des National Institute of Environmental Health Sciences dar.
Materials
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe – a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250×10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
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