Fjerning og utskifting av endogene ligander fra Lipidbundne proteiner og allergener
Summary
Denne protokollen beskriver fjerning av endogene lipider fra allergener, og deres erstatning med brukerangitte ligander gjennom omvendt fase HPLC kombinert med termisk annealing. 31 P-NMR og sirkulær dikroisme muliggjør rask bekreftelse av ligandfjerning/lasting, og gjenvinning av innfødt allergenstruktur.
Abstract
Mange store allergener binder seg til hydrofobe lipidlignende molekyler, inkludert Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 og Fel d 1. Disse ligandene er sterkt beholdt og har potensial til å påvirke sensibiliseringsprosessen enten gjennom direkte stimulering av immunsystemet eller endring av biofysiske egenskaper til det allergifremkallende proteinet. For å kontrollere for disse variablene er det nødvendig med teknikker for fjerning av endogenede bundet ligander og om nødvendig erstatning med lipider av kjent sammensetning. Kakerlakkallergenet Bla g 1 omslutter et stort hydrofobt hulrom som binder en heterogen blanding av endogene lipider når de renses ved hjelp av tradisjonelle teknikker. Her beskriver vi en metode der disse lipidene fjernes ved hjelp av omvendt fase HPLC etterfulgt av termisk gløding for å gi Bla g 1 i enten Apo-form eller lastet på nytt med en brukerdefinert blanding av fettsyre eller fosfolipidlaster. Kobling av denne protokollen med biokjemiske analyser avslører at fettsyrelaster betydelig endrer termo ustabiliteten og proteolytisk motstand av Bla g 1, med nedstrøms implikasjoner for frekvensen av T-celle epitopgenerering og allergifremkallende. Disse resultatene fremhever viktigheten av lipidfjerning / reloading protokoller som den som er beskrevet heri når du studerer allergener fra både rekombinante og naturlige kilder. Protokollen er generaliserbar for andre allergenfamilier, inkludert lipocalins (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) og Uteroglobin (Fel d 1), og gir et verdifullt verktøy for å studere lipidenes rolle i den allergiske responsen.
Introduction
En undersøkelse av allergendatabasen avslører at allergener finnes i bare 2% av alle kjente proteinfamilier, noe som tyder på at vanlige funksjonelle og biofysiske egenskaper bidrar til allergifremkallende1. Av disse egenskapene synes evnen til å binde lipidlaster å være sterkt overrepresentert blant allergener, noe som tyder på at disse lastene kan påvirke sensibiliseringsprosessen1. Faktisk har det vist seg at Brasil Nut allergen Ber e 1 krever samtidig administrasjon med sin endogene lipid for å realisere sitt fulle sensibiliserende potensial2. Disse lipidene kan potensielt stimulere immunforsvaret direkte som illustrert av myteallergenene Der p 2 og Der p 7, som begge deler en sterk strukturell homologi med LPS-bindende proteiner3,4,5. Basert på denne observasjonen ble det foreslått at Derp 2 og Der p 7 kunne binde bakterielle lipider og direkte stimulere vertsimmunsystemet gjennom TLR4-mediert signalering, noe som letter sensibiliseringsprosessen5,6. Det er også mulig at endogene bundet lipider kan endre de biofysiske egenskapene til allergifremkallende proteiner selv. For eksempel, evnen til Sin a 2 (sennep) og Ara h 1 (peanøtter) til å samhandle med fosfolipid vesicles betydelig forbedret deres motstand mot mage og endosomal nedbrytning7, mens ligand binding til de store bjørk pollen allergen Bet v 1 endret både graden av endosomal behandling og mangfoldet av de resulterende peptider8. Dette er spesielt relevant for allergifremkallende gitt korrelasjonen som er observert mellom stabilitet, T-celle epitopgenerering og allergifremkallende for proteiner som Bet v 1 og Bla g 1; sistnevnte vil være gjenstand for dette arbeidet9,10.
Bla g 1 representerer det prototypiske medlemmet av insektet Major Allergen (MA) proteinfamilien, og har en unik struktur bestående av 12 amfipatiske alfahælika som omslutter et unormalt stort hydrofobt hulrom9,11. Den tilgjengelige røntgenkrystallstrukturen til Bla g 1 viser elektrontetthet i dette hulrommet i samsvar med bundet fosfolipid eller fettsyreligander; en formodning bekreftet av 31P-NMR og massespektrometri. Disse lastene var heterogene i naturen, og deres sammensetning var sterkt avhengig av allergenkilden, med forskjellige lipidprofiler observert for rekombinant Bla g 1 uttrykt i E. coli og P. pastoris. Merkelig nok inneholdt Bla g 1 renset fra sin naturlige allergenkilde (kakerlakkfrass) overveiende fettsyrer i bindingsstedet, med en blanding av palmitat, oleat og stearate som ble identifisert som sine “naturlige” ligander9,11. Bla g 1s evne til å beholde lipider og fettsyrer etter flere rensetrinn hindrer arbeidet med å studere proteinet isolert. Omvendt har det blitt antydet at den naturlige palmitaten, stearate og oleate ligander av Bla g 1 (heretter referert til som nMix) spiller en nøkkelrolle i både dens allergifremkallende og innfødte biologiske funksjon9. Disse ligandene er imidlertid ikke til stede i Bla g 1 hentet fra rekombinante kilder, noe som gjør det vanskelig å vurdere denne hypotesen. Lignende problemer har blitt observert for andre lipidbindingsallergener som Bet v 112,13. For å lette den systematiske studien av lipid-allergeninteraksjoner har vi utviklet en protokoll der allergener kan bli kvantitativt strippet for sine endogene bundet lipider og rekonstituert i enten Apo-form eller lastet med spesifikke ligander.
Allergener renses oftest fra sine naturlige eller rekombinante kilder ved hjelp av affinitetskromatografi og/eller størrelsesekskluderingskromatografi. Her introduserer vi et ekstra rensetrinn i form av høyytelses væskekromatografi (HPLC) som bruker en omvendt fase C18-kolonne hvorfra allergenet slippes inn i et organisk løsningsmiddel som ligner protokoller utviklet for fettsyrebindingsproteiner14. Det resulterende proteinet blir deretter utsatt for et termisk annealing trinn i fravær eller tilstedeværelse av fettsyrer og / eller fosfolipider. I tillegg til å gjenvinne den innfødte Bla g 1-folden, øker de forhøyede temperaturene løseligheten og tilgjengeligheten til lipidlastene, noe som gir Bla g 1 i enten Apo-formen eller jevnt lastet med ønsket hydrofob ligand. 31 P-NMR spektra av Bla g 1 renset på denne måten bekreftet fullstendig fjerning av endogenede bundet ligander og ensartet erstatning med de ønskede forbindelser, mens sirkulær dikroisme bekreftet vellykket utvinning av Bla g 1 fold. Nytten av denne metoden er fremhevet i et nylig arbeid der lastbinding ble funnet å forbedre Bla g 1 termo ustabilitet og proteolytisk motstand, og endret kinetikken til T-celle epitopgenerering med potensielle implikasjoner for sensibilisering og allergifremkallende9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet i dette arbeidet har blitt brukt til systematisk å studere lipidbindingsegenskapene til Bla g 1. Dette avslørte en sammenheng mellom lastbinding, termo ustabilitet og endosomal behandling, hvorav sistnevnte var korrelert med reduksjon i genereringen av en kjent T-celle epitop med potensielle implikasjoner for immunogenisitet9,18. I tillegg til Bla g 1 har andre allergener som Pru p 3 og Bet v 1 vist seg å beholde sine endogene last når d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil takke Dr. Tom Kirby, Scott Gabel og Dr. Robert London for deres hjelp og hjelp gjennom dette arbeidet, sammen med Dr. Bob Petrovich og Lori Edwards for bruken av deres instrumentering og deres hjelp til å generere Bla g 1-konstruksjonene som er ansatt i denne studien. Vi takker Andrea Adams for hjelp med massespektrometrien, og Dr. Eugene DeRose for hjelp med NMR-instrumenteringen. Denne forskningen ble støttet av Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Environmental Health Sciences, Z01-ES102906 (GAM). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institute of Environmental Health Sciences.
Materials
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe – a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250×10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
- Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
- Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
- Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
- Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
- Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
- Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
- Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
- Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
- Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
- Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
- Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
- Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
- Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. 생화학. 24 (15), 3821-3826 (1985).
- Delaglio, F., et al. Nmrpipe – a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
- Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
- Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
- Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
- Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
- Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
- Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
- Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
- Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
- Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
- Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
- Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
- Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
- Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
- Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
- Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
- de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
- Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
- Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
- Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).
