JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Удаление и замена эндогенных лигандов из липид-связанных белков и аллергенов

Published: February 24, 2021
doi:
10.3791/61780
, ,
1Nuclear Magnetic Resonance Group,National Institute of Environmental Health Sciences

Summary

Этот протокол описывает удаление эндогенных липидов из аллергенов и их замену указанными пользователем лигандами посредством обратнофазной ВЭЖХ в сочетании с термическим отжигом. 31 31 P-ЯМР и круговой дихроизм позволяют быстро подтвердить удаление/нагрузку лиганда и восстановление нативной структуры аллергена.

Abstract

Многие основные аллергены связываются с гидрофобными липидоподобными молекулами, включая Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 и Fel d 1. Эти лиганды сильно сохраняются и могут влиять на процесс сенсибилизации либо путем прямой стимуляции иммунной системы, либо путем изменения биофизических свойств аллергенного белка. Для контроля этих переменных требуются методы удаления эндогенно связанных лигандов и, при необходимости, замещения липидами известного состава. Аллерген таракана Bla g 1 заключает в себе большую гидрофобную полость, которая связывает гетерогенную смесь эндогенных липидов при очистке с использованием традиционных методов. Здесь мы описываем способ, с помощью которого эти липиды удаляются с использованием обратнофазной ВЭЖХ с последующим термическим отжигом с получением Bla g 1 в его Апо-форме или перезагружается пользовательской смесью жирных кислот или фосфолипидных грузов. Соединение этого протокола с биохимическими анализами показывает, что грузы жирных кислот значительно изменяют термостабильность и протеолитическую устойчивость Bla g 1, что имеет последующие последствия для скорости генерации эпитопа Т-клеток и аллергенности. Эти результаты подчеркивают важность протоколов удаления/перезагрузки липидов, таких как описанный в настоящем описании, при изучении аллергенов как из рекомбинантных, так и из природных источников. Протокол обобщается на другие семейства аллергенов, включая липокалины (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) и Утероглобин (Fel d 1), обеспечивая ценный инструмент для изучения роли липидов в аллергической реакции.

Introduction

Исследование базы данных аллергенов показывает, что аллергены встречаются только в 2% всех известных семейств белков, предполагая, что общие функциональные и биофизические свойства способствуют аллергенности1. Из этих свойств способность связывать липидные грузы, по-видимому, сильно перепредставлена среди аллергенов, что позволяет предположить, что эти грузы могут влиять на процесс сенсибилизации1. Действительно, было показано, что аллерген бразильского ореха Ber e 1 требует совместного введения с его эндогенным липидом для реализации его полного сенсибилизирующего потенциала2. Эти липиды могут потенциально стимулировать иммунную систему непосредственно, как показано аллергенами клеща Der p 2 и Der p 7, оба из которых имеют сильную структурную гомологию с LPS-связывающими белками3,4,5. На основе этого наблюдения было высказано предположение, что Derp 2 и Der p 7 могут связывать бактериальные липиды и непосредственно стимулировать иммунную систему хозяина посредством TLR4-опосредования сигнализации, облегчая процесс сенсибилизации5,6. Также возможно, что эндогенно связанные липиды могут изменять биофизические свойства самих аллергенных белков. Например, способность Sin a 2 (горчица) и Ara h 1 (арахис) взаимодействовать с фосфолипидными везикулами значительно усилила их устойчивость к желудочной и эндосомальной деградации7,в то время как связывание лигандов с основным аллергеном пыльцы березы Bet v 1 изменяло как скорость эндосомальной обработки, так и разнообразие полученныхпептидов 8. Это особенно актуально для аллергенности, учитывая корреляцию, которая наблюдалась между стабильностью, генерацией эпитопа Т-клеток и аллергенностью для белков, таких как Bet v 1 и Bla g 1; последний из которых будет предметом настоящей работы9,10.

Bla g 1 представляет собой прототип члена семейства белков основных аллергенов насекомых (MA) и обладает уникальной структурой, состоящей из 12 амфипатических альфа-хеликул, которые заключают аномально большую гидрофобную полость9,11. Доступная рентгеновская кристаллическая структура Bla g 1 показывает электронную плотность в этой полости, согласуемую со связанными фосфолипидными или жирными кислотными лигандами; гипотеза, подтвержденная 31П-ЯМР и масс-спектрометрией. Эти грузы были неоднородными по своей природе, и их состав сильно зависел от источника аллергена, причем различные липидные профили наблюдались для рекомбинантного Bla g 1, выраженного у E. coli и P. pastoris. Любопытно, что Bla g 1, очищенный от своего естественного источника аллергена (таракан фрасс), содержал преимущественно жирные кислоты в своем месте связывания, причем смесь пальмитата, олеата и стеарата была идентифицирована как его «естественные» лиганды9,11. Способность Bla g 1 удерживать липиды и жирные кислоты после нескольких этапов очистки препятствует усилиям по изучению белка в изоляции. И наоборот, было высказано предположение, что естественные пальмитатные, стеаратные и олеатные лиганды Bla g 1 (далее именуемые nMix) играют ключевую роль как в его аллергенности, так и в нативной биологической функции9. Однако эти лиганды отсутствуют в Bla g 1, полученном из рекомбинантных источников, что затрудняет оценку этой гипотезы. Аналогичные проблемы наблюдались для других аллергенов, связывающих липиды, таких как Bet v1 12,13. Чтобы облегчить систематическое изучение липидно-аллергенных взаимодействий, мы разработали протокол, с помощью которого аллергены могут быть количественно лишены своих эндогенно связанных липидов и восстановлены либо в Апо-форме, либо загружены специфическими лигандами.

Аллергены чаще всего очищают от их естественных или рекомбинантных источников с использованием аффинной хроматографии и/или хроматографии с исключением размера. Здесь мы вводим дополнительную стадию очистки в виде высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием колонки C18 обратной фазы, из которой аллерген элюируется в органический растворитель, аналогичный протоколам, разработанным для белков14 связыванияжирных кислот. Полученный белок затем подвергают термическому отжигу в отсутствие или присутствие жирных кислот и/или фосфолипидов. В дополнение к восстановлению нативного Bla g 1 раза, повышенные температуры увеличивают растворимость и доступность липидных грузов, давая Bla g 1 либо в Апо-форме, либо равномерно загруженный желаемым гидрофобным лигандом. 31 31 Очищенные таким образом P-ЯМР спектры Bla g 1 подтвердили полное удаление эндогенно связанных лигандов и равномерное замещение желаемыми соединениями, в то время как круговой дихроизм подтвердил успешное восстановление Bla g 1 раза. Полезность этого метода подчеркивается в недавней работе, в которой было обнаружено, что связывание груза усиливает термостабильность Bla g 1 и протеолитическую резистентность, изменяя кинетику генерации эпитопов Т-клеток с потенциальными последствиями для сенсибилизации и аллергенности9.

Protocol

1. Bla g 1 клонирование Получают ген таракана аллерген Bla g 1.0101 (остатки 34-216), представляющий собой единый повтор домена МА. Для простоты Bla g 1 будет использоваться на протяжении всей работы, чтобы представить этот единственный повтор, а не всю стенограмму Bla g 1.0101. Субклон г…

Representative Results

Используя аффинную хроматографию, рекомбинантный GST-Bla g 1 легко изолировали до высокого уровня чистоты(Рисунок 1A),получая выход ~ 2-4 мг / л клеточной культуры. Ночной инкубации с протеазой TEV при 4 °C достаточно для удаления метки GST, в результате получения конечного продукта при ~24 …

Discussion

Протокол, описанный в данной работе, был успешно применен для систематического изучения липидсвязывающих свойств Bla g 1. Это выявило корреляцию между связыванием груза, термостабильностью и эндосомальной обработкой, последняя из которых коррелировала со снижением генерации известног?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Тома Кирби, Скотта Габеля и д-ра Роберта Лондона за их помощь и содействие на протяжении всей этой работы, а также д-ра Боба Петровича и Лори Эдвардс за использование их инструментов и их помощь в создании конструкций Bla g 1, используемых в этом исследовании. Мы благодарим Андреа Адамс за помощь в масс-спектрометрии и доктора Юджина ДеРоуза за помощь с приборами ЯМР. Это исследование было поддержано Программой внутренних исследований NIH, Национальным институтом наук о здоровье окружающей среды, Z01-ES102906 (GAM). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национального института наук о гигиене окружающей среды.

Materials

Bla g 1 Gene  Genescript N/a Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216
Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) Indoor biotechnologies N/a Custom order
Agilent 1100 Series HPLC System Agilent G1315B, G1311A, G1322A UV Detector, Pump, and Degasser
Agilent DD2 600 MHz spectrometer Agilent N/a
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Amicon UFC-1008
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
Benzonase Sigma-Aldrich E1014-5KU
Broad- band 5 mm Z-gradient probe Varian N/a
ChemStation for LC (Software) Agilent N/a
cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) Avanti Polar Lipids 850365C
E. Coli BL21 DE3 Cells New England Biolabs C2530H
Freezone 4.5 Freeze Dry System Labconco 7750000
Glutathione Resin Genescript L00206
Glutathione, Reduced Fisher Scientific BP25211
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher Scientific 34060
Jasco  CD spectropolarimeter Jasco J-815
Millex Syringe Filter Unit EMD Millipore SLGS033SS
NMRPipe (Software) Delaglio et al.  N/a Delaglio, F. et al. Nmrpipe – a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995).
NMRViewJ (Software) Johnson et al.  N/a Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994).
Oleic acid Sigma-Aldrich O1008
Pierce BCA Protein Assay Sigma-Aldrich BCA1-1KT
Polaris 5 C18-A 250×10.0 mm HPLC Column Agilent SKU: A2000250X100
SD-200 Vacuum Pump Varian VP-195
Sodium Cholate Hydrate Sigma-Aldrich C6445
Sodium Palmitate Sigma-Aldrich P9767
Sodium Stearate Sigma-Aldrich S3381
VnmrJ (Software) Varian N/a
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
  2. Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
  3. Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
  4. Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
  5. Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
  6. Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
  7. Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
  8. Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
  9. Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
  10. Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
  11. Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
  12. Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
  13. Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
  14. Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
  15. Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. 생화학. 24 (15), 3821-3826 (1985).
  16. Delaglio, F., et al. Nmrpipe – a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  17. Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
  18. Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
  19. Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
  20. Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
  21. Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
  22. Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
  23. Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
  24. Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
  25. Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
  26. Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
  27. Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
  28. Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
  29. Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
  30. Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
  31. Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
  32. Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
  33. de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
  34. Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
  35. Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
  36. Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).

Tags

Keywords: Endogenous LigandsLipid-bound ProteinsAllergensReverse-phase HPLCThermal AnnealingSolubilizationBla G 1De-lipidationLyophilizationProtein Yield
check_url/kr/61780?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Foo, A. C. Y., Thompson, P. M., Mueller, G. A. Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens. J. Vis. Exp. (168), e61780, doi:10.3791/61780 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image