Avlägsnande och ersättning av endogena ligander från lipidbundna proteiner och allergener
Summary
Detta protokoll beskriver avlägsnandet av endogena lipider från allergener, och deras ersättning med användarspecificerade ligander genom omvänd fas HPLC i kombination med termisk glödgning. 31 (31) P-NMR och cirkulär dichroism möjliggör snabb bekräftelse av ligand borttagning /lastning, och återvinning av inhemska allergen struktur.
Abstract
Många stora allergener binder till hydrofobiska lipidliknande molekyler, inklusive Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 och Fel d 1. Dessa ligander är starkt behållna och har potential att påverka sensibiliseringsprocessen antingen genom att direkt stimulera immunsystemet eller ändra de biofysiska egenskaperna hos det allergiframkallande proteinet. För att kontrollera dessa variabler krävs tekniker för avlägsnande av endogent bundna ligands och vid behov ersätta lipider med känd komposition. Kackerlackan allergen Bla g 1 omsluter en stor hydrofobisk hålighet som binder en heterogen blandning av endogena lipider när de renas med traditionella tekniker. Här beskriver vi en metod genom vilken dessa lipider avlägsnas med hjälp av omvänd fas HPLC följt av termisk glödgning för att ge Bla g 1 i antingen dess Apo-form eller laddas om med en användardefinierad blandning av fettsyra eller fosfolipid laster. Koppling av detta protokoll med biokemiska analyser visar att fettsyralaster avsevärt förändrar termostabiliteten och proteolytisk resistens hos Bla g 1, med nedströms konsekvenser för T-cells epitopgenerering och allergiframkallande egenskaper. Dessa resultat belyser vikten av lipid borttagning/omladdning protokoll såsom den som beskrivs häri när studera allergener från både rekombinanta och naturliga källor. Protokollet är generaliserbart för andra allergenfamiljer inklusive lipokoliner (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) och Uteroglobin (Fel d 1), vilket ger ett värdefullt verktyg för att studera lipidernas roll i det allergiska svaret.
Introduction
En undersökning av allergendatabasen visar att allergener finns i endast 2% av alla kända proteinfamiljer, vilket tyder på att vanliga funktionella och biofysiska egenskaper bidrar till allergiframkallandeegenskaper 1. Av dessa egenskaper verkar förmågan att binda lipidlaster vara starkt överrepresenterad bland allergener, vilket tyder på att dessa laster kan påverka sensibiliseringsprocessen1. Det har faktiskt visat sig att Brasiliens mutter allergen Ber e 1 kräver samadministration med sin endogena lipid för att förverkliga sin fulla sensibiliserande potential2. Dessa lipider kan potentiellt stimulera immunsystemet direkt som illustreras av mitten allergenerna Der p 2 och Der p 7, som båda delar en stark strukturell homologi med LPS-bindande proteiner3,4,5. Baserat på denna observation föreslogs att Derp 2 och Der p 7 kunde binda bakteriella lipider och direkt stimulera värdimmunsystemet genom TLR4-medierad signalering, vilket underlättade sensibiliseringsprocessen5,6. Det är också möjligt att endogent bundna lipider kan förändra de biofysiska egenskaperna hos allergiframkallande proteiner själva. Till exempel förbättrade Förmågan hos Sin a 2 (senap) och Ara h 1 (jordnötter) att interagera med fosfolipid vesiklar avsevärt deras motståndskraft mot mag- och endosomal nedbrytning7, medan ligand bindning till den stora björkpollen allergenEt Bet v 1 förändrade både frekvensen av endoskopisk bearbetning och mångfalden av de resulterande peptiderna8. Detta är särskilt relevant för allergiframkallande egenskaper med tanke på det samband som har observerats mellan stabilitet, T-cells epitopgenerering och allergiframkallande egenskaper för proteiner som Bet v 1 och Bla g 1; varav det senare kommer att bli föremål för detta arbete9,10.
Bla g 1 representerar den prototypiska medlemmen av insekten Major Allergen (MA) proteinfamilj, och har en unik struktur bestående av 12 amfipatiska alfahelices som omger en onormalt stor hydrofobisk hålighet9,11. Den tillgängliga röntgenkristallstrukturen i Bla g 1 visar elektrontätheten i denna hålighet som överensstämmer med bundna fosfolipider eller fettsyraligander; en gissning bekräftad av 31P-NMR och masspektrometri. Dessa laster var heterogena till sin natur och deras sammansättning var starkt beroende av allergenkällan, med olika lipidprofiler observerade för rekombinant Bla g 1 uttryckt i E. coli och P. pastoris. Märkligt nog innehöll Bla g 1 renad från sin naturliga allergenkälla (kackerlackssp frass) övervägande fettsyror inom sitt bindningsställe, med en blandning av palmitat, oleat och stearat som identifierades som dess “naturliga” ligander9,11. Bla g 1:s förmåga att behålla lipider och fettsyror efter flera reningsinsatser hindrar försöken att studera proteinet isolerat. Omvänt har det föreslagits att den naturliga palmitate, stearate och oleate ligands av Bla g 1 (hädanefter kallad nMix) spelar en nyckelroll i både dess allergiframkallande och inhemska biologiska funktion9. Dessa ligands är dock inte närvarande i Bla g 1 som erhållits från rekombinanta källor, vilket gör det svårt att bedöma denna hypotes. Liknande problem har observerats för andra lipidbindnings allergener som Bet v 112,13. För att underlätta den systematiska studien av lipid-allergeninteraktioner har vi utvecklat ett protokoll genom vilket allergener kvantitativt kan tas bort från sina endogent bundna lipider och rekonstitueras i antingen Apo-form eller laddas med specifika ligander.
Allergener renas oftast från sina naturliga eller rekombinanta källor med hjälp av affinitetskromatografi och/eller storleksuteslutning kromatografi. Här introducerar vi ytterligare ett reningssteg i form av högpresterande flytande kromatografi (HPLC) med en omvänd fas C18-kolumn från vilken allergenet elueras till ett organiskt lösningsmedel som liknar protokoll som utvecklats för fettsyrabindande proteiner14. Det resulterande proteinet utsätts sedan för ett termiskt glödgningssteg i frånvaro eller förekomst av fettsyror och/eller fosfolipider. Förutom att återvinna den inhemska Bla g 1-vikningen ökar de förhöjda temperaturerna lösligheten och tillgängligheten hos lipidlasterna, vilket ger Bla g 1 i antingen Apo-form eller jämnt laddad med önskad hydrofobisk ligand. 31 (31) P-NMR spektra av Bla g 1 renas på detta sätt bekräftade fullständig avlägsnande av endogent bundna ligands och enhetlig ersättning med önskade föreningar, medan cirkulär dikhroism bekräftade framgångsrik återhämtning av Bla g 1 gånger. Nyttan av denna metod lyfts fram i ett nyligen arbete där lastbindning konstaterades förbättra Bla g 1 termostabilitet och proteolytiskt motstånd, ändra kinetiken för T-cells epitopgenerering med potentiella konsekvenser för sensibilisering och allergiframkallandeegenskaper 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs i detta arbete har framgångsrikt tillämpats för att systematiskt studera lipidbindningsegenskaperna hos Bla g 1. Detta visade ett samband mellan lastbindning, termostabilitet och endosomal bearbetning, varav den senare var korrelerad med minskning av genereringen av en känd T-cells epitop med potentiella konsekvenser för immunogenicitet9,18. Förutom Bla g 1 har andra allergener som Pru p 3 och Bet v 1 visat sig behålla sina endogen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr. Tom Kirby, Scott Gabel och Dr. Robert London för deras hjälp och hjälp under hela detta arbete, tillsammans med Dr. Bob Petrovich och Lori Edwards för användningen av deras instrumentering och deras hjälp med att generera Bla g 1-konstruktionerna som används i denna studie. Vi tackar Andrea Adams för hjälp med masspektrometrin och Dr. Eugene DeRose för hjälp med NMR-instrumenteringen. Denna forskning stöddes av NIH: s intramurala forskningsprogram, National Institute of Environmental Health Sciences, Z01-ES102906 (GAM). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institute of Environmental Health Sciences.
Materials
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe – a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250×10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
- Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
- Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
- Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
- Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
- Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
- Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
- Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
- Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
- Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
- Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
- Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
- Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
- Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. 생화학. 24 (15), 3821-3826 (1985).
- Delaglio, F., et al. Nmrpipe – a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
- Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
- Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
- Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
- Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
- Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
- Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
- Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
- Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
- Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
- Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
- Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
- Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
- Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
- Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
- Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
- de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
- Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
- Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
- Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).
