Lipid'e Bağlı Proteinler ve Alerjenlerden Endojen Ligandların Çıkarılması ve Değiştirilmesi
Summary
Bu protokol, endojen lipitlerin alerjenlerden uzaklaştırılmasını ve termal tavlama ile birleştiğinde ters faz HPLC ile kullanıcı tarafından belirtilen ligandlarla değiştirilmesini açıklar. 31 P-NMR ve dairesel dikroizm, ligand çıkarma/yüklemenin hızlı bir şekilde onaylanmasına ve doğal alerjen yapısının geri kazanılmasına izin verir.
Abstract
Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 ve Fel d 1 dahil olmak üzere birçok büyük alerjen hidrofobik lipid benzeri moleküllere bağlanır. Bu ligandlar güçlü bir şekilde korunur ve bağışıklık sistemini doğrudan uyararak veya alerjenik proteinin biyofiziksel özelliklerini değiştirerek duyarlılık sürecini etkileme potansiyeline sahiptir. Bu değişkenleri kontrol etmek için, endojen olarak bağlı ligandların çıkarılması ve gerekirse bilinen bileşimin lipitleri ile değiştirilmesi için teknikler gereklidir. Hamamböceği alerjeni Bla g 1, geleneksel teknikler kullanılarak saflaştırıldığında endojen lipitlerin heterojen bir karışımını bağlayan büyük bir hidrofobik boşluğu çevreler. Burada, bu lipitlerin ters fazlı HPLC kullanılarak çıkarıldığı ve ardından Apo formunda Bla g 1’i elde etmek için termal tavlamanın veya kullanıcı tanımlı bir yağ asidi veya fosfolipid kargo karışımı ile yeniden yüklendiğini açıklıyoruz. Bu protokolü biyokimyasal testlerle birebir hale getiren yağ asidi yüklerinin Bla g 1’in termostabilitesini ve proteolitik direncini önemli ölçüde değiştirdiğini, T hücre epitopu üretimi ve alerjeniklik oranı için aşağı yönlü etkileri olduğunu ortaya koymaktadır. Bu sonuçlar, hem rekombinant hem de doğal kaynaklardan alerjenleri incelerken burada açıklanan gibi lipit çıkarma/yeniden yükleme protokollerinin önemini vurgulamaktadır. Protokol, lipitlerin alerjik yanıttaki rolünü incelemek için değerli bir araç sağlayan lipokalinler (Muş m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) ve Uteroglobin (Fel d 1) dahil olmak üzere diğer alerjen aileler için genelleştirilebilir.
Introduction
Alerjen veritabanında yapılan bir anket, alerjenlerin bilinen tüm protein ailelerinin sadece% 2’sinde bulunduğunu ortaya koymaktadır, bu da ortak fonksiyonel ve biyofiziksel özelliklerin alerjenikliğe katkıda bulunduğunu göstermektedir1. Bu özelliklerden, lipid yüklerini bağlama yeteneği alerjenler arasında güçlü bir şekilde aşırı temsil edilmiş gibi görünmektedir, bu da bu kargoların duyarlılık sürecini etkileyebileceğini düşündürmektedir1. Gerçekten de, Brezilya Somun alerjeni Ber e 1’in tam duyarlılık potansiyelini gerçekleştirmek için endojen lipid ile birlikte yönetim gerektirdiği gösterilmiştir2. Bu lipitler, her ikisi de LPS bağlayıcı proteinler 3 ,4,5ile güçlü bir yapısal homolojiyi paylaşan akar alerjenleri Der p 2 ve Der p7tarafından gösterildiği gibi bağışıklık sistemini doğrudan uyarabilir. Bu gözleme dayanarak, Derp 2 ve Der p 7’nin bakteriyel lipitleri bağlayabileceği ve TLR4 aracılı sinyal yoluyla konak bağışıklık sistemini doğrudan uyarabileceği ve duyarlılık sürecini kolaylaştırabileceği önerildi5,6. Endojen olarak bağlanmış lipitlerin alerjenik proteinlerin biyofiziksel özelliklerini kendileri değiştirebileceği de mümkündür. Örneğin, Sin a 2 (hardal) ve Ara h 1’in (yer fıstığı) fosfolipid veziküllerle etkileşime girme yeteneği mide ve endosomal bozulmaya karşı dirençlerini önemli ölçüde artırdı7, ana huş poleni alerjen Bet v 1’e ligand bağlanması hem endosomal işlem oranını hem de ortaya çıkan peptitlerin çeşitliliğini değiştirdi8. Bu özellikle Bet v 1 ve Bla g 1 gibi proteinler için stabilite, T hücre epitop üretimi ve alerjeniklik arasında gözlenen korelasyon göz önüne alındığında alerjeniklikle ilgilidir; ikincisi bu çalışmanın konusu olacak9,10.
Bla g 1, böcek Major Allergen (MA) protein ailesinin prototipik üyesini temsil eder ve anormal derecede büyük bir hidrofobik boşluğu9,11 içine alan12amfipatik alfa helikesten oluşan benzersiz bir yapıya sahiptir. Bla g 1’in mevcut X-ışını kristal yapısı, bağlı fosfolipid veya yağ asidi ligandları ile tutarlı olarak bu boşluk içindeki elektron yoğunluğunu gösterir; 31P-NMR ve kütle spektrometresi tarafından doğrulanmış bir varsayım. Bu kargolar doğada heterojendi ve bileşimleri alerjen kaynağına büyük ölçüde bağlıydı, E. coli ve P. pastoris’teifade edilen rekombinant Bla g 1 için farklı lipid profilleri gözlendi. İlginç bir şekilde, Bla g 1 doğal alerjen kaynağından (hamamböceği frass) arındırıldı, bağlama alanında ağırlıklı olarak yağ asitleri içeriyordu, palmitat, oleat ve stearat karışımı “doğal” ligands9,11olarak tanımlanıyor. Bla g 1’in birden fazla saflaştırma adımını takiben lipitleri ve yağ asitlerini tutma yeteneği, proteini izole bir şekilde inceleme çabalarını engeller. Tersine, Bla g 1’in doğal palmitat, stearat ve oleat ligandlarının (bundan böyle nMix olarak adlandırılır) hem alerjenikliği hem de yerel biyolojik işlevinde önemli bir rol oynadığı öne sürülmektedir9. Bununla birlikte, bu ligandlar rekombinant kaynaklardan elde edilen Bla g 1’de bulunmaz ve bu hipotezi değerlendirmeyi zorlaştırır. Bet v 112,13gibi diğer lipid bağlayıcı alerjenler için de benzer sorunlar gözlenmiştir. Lipid-alerjen etkileşimlerinin sistematik çalışmasını kolaylaştırmak için, alerjenlerin endojen olarak bağlanmış lipitlerinden nicel olarak sıyrılabilecekleri ve Apo formunda veya belirli ligandlarla yüklenebilecekleri bir protokol geliştirdik.
Alerjenler en sık benzeşim kromatografisi ve/veya boyut dışlama kromatografisi kullanılarak doğal veya rekombinant kaynaklarından arındırılır. Burada, alerjenin yağ asidi bağlayıcı proteinler için geliştirilen protokollere benzer organik bir çözücüye dönüştürdürüldü ters fazlı bir C18 sütunu kullanan yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) şeklinde ek bir saflaştırma adımı sunuyoruz14. Elde edilen protein daha sonra yağ asitlerinin ve / veya fosfolipidlerin yokluğunda veya varlığında termal bir tavlama adımına tabi tutulur. Yerel Bla g 1 katını kurtarmanın yanı sıra, yüksek sıcaklıklar lipid yüklerinin çözünürlüğü ve erişilebilirliğini arttırır, Apo formunda veya istenen hidrofobik ligand ile düzgün bir şekilde yüklenen Bla g 1’i verir. 31 Bla g 1’in P-NMR spektrumu bu şekilde saflaştırılarak endojen olarak bağlanmış ligandların tamamen çıkarılması ve istenen bileşiklerle tek tip değiştirilmesi doğrulanırken, dairesel dikroizm Bla g 1 kıvrımının başarılı bir şekilde geri kazanılmasını doğruladı. Bu yöntemin faydası, kargo bağlamanın Bla g 1 termostabilitesini ve proteolitik direncini artırdığı, T hücre epitopu neslinin kinetiğini duyarlılık ve alerjeniklik için potansiyel etkileri olan değiştirdiği yeni bir çalışmada vurgulanmıştır9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada açıklanan protokol, Bla g 1’in lipit bağlama özelliklerini sistematik olarak incelemek için başarıyla uygulanmıştır. Bu, kargo bağlama, termostabiliyet ve endosomal işleme arasında bir korelasyon ortaya koydu, ikincisi bilinen bir T hücre epitopunun neslindeki azalma ile immünojeniklik için potansiyel etkileri ile ilişkiliydi9,18. Bla g 1’e ek olarak, Pru p 3 ve Bet v 1 gibi diğer alerjenlerin, standart benzeşim ve boyut dışla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Tom Kirby, Scott Gabel ve Dr. Robert London’a bu çalışma boyunca yardımları ve yardımları için, Dr. Bob Petrovich ve Lori Edwards’a enstrümantasyonlarını kullandıkları ve bu çalışmada kullanılan Bla g 1 yapılarının oluşturulmasındaki yardımları için teşekkür ederiz. Kitle spektrometresi konusunda yardım için Andrea Adams’a ve NMR enstrümantasyonuna yardım için Dr. Eugene DeRose’a teşekkür ederiz. Bu araştırma NIH, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü, Z01-ES102906 (GAM) Intramural Araştırma Programı tarafından desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü’nün resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe – a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250×10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
- Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
- Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
- Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
- Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
- Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
- Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
- Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
- Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
- Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
- Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
- Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
- Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
- Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. 생화학. 24 (15), 3821-3826 (1985).
- Delaglio, F., et al. Nmrpipe – a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
- Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
- Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
- Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
- Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
- Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
- Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
- Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
- Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
- Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
- Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
- Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
- Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
- Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
- Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
- Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
- de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
- Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta – Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
- Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
- Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).
